微RNA<em>原位</em>杂交的福尔马林固定的肾组织
Summary
本文介绍了比色法检测福尔马林固定的肾部分microRNA表达谱进行优化的原位杂交协议。
Abstract
在本文中，我们通过与地高辛原位杂交描述了在肾脏比色法检测miRNA的方法标记的小分子RNA探针。这个协议中，最初是由Kloosterman和同事们用Exiqon miRNA探针1广泛使用而开发的，已被修改以克服固有的miRNA分析在肾组织中的挑战。这些包括诸如结构识别和难以除去残留的探针和抗体。使用比较薄的，厚5毫米，可清晰肾脏结构的可视化，同时强大的探测信号被保留在细胞组织切片。此外，探针浓度和培养条件进行了优化，以方便与低背景和非特异信号的microRNA表达谱的可视化。此处，优化的协议进行了说明，通过幻灯片在该过程结束时，安装覆盖所述初始组织收集和制备。其基本组件管理此协议的NTS可以改变应用到其它组织和细胞培养模型。
Introduction
微RNA是小（约22个核苷酸长），非编码所产生的内源性的RNA。他们一般通过功能翻译抑制或mRNA降解，抑制蛋白的表达。的miRNA结合到靶mRNA不完全互补，从而有可能为一个单一的miRNA抑制多个目标。
了解哪些类型的细胞和结构表达的miRNA是理解机制的重要组成部分，通过它在miRNA的表达影响细胞和组织表型的改变。而方法如miRNA的测序，定量PCR和Northern杂交可用于检测在整个组织中的miRNA，这种方法不允许之一，以确定哪个特定的细胞类型，他们从一个给定组织中来了。使用这些方法和蜂窝结构成分分析之前夹层可以是非常困难的，以获得足够的隔离度所需的条件能导致人terations在基因表达或RNA的降解。微小RNA 原位杂交是用于可视化组织中微小RNA的位置和表达水平的方法。这种技术是在组织异质结构，如肾组成的特别有价值。
小分子RNA已被证明发挥肾脏发育2,3和生理学4的调节作用。微小RNA表达的改变也被证明参与与肾脏病理如纤维化5-10，糖尿病肾病7，肾癌11,12，和急性肾损伤13。在我们的研究中，我们已经发现， 在对肾组织原位杂交优化微小RNA是用于确定miRNA的表达在健康和疾病14的确切结构的位置有价值。不同的microRNA的管状和细胞表达的测定是很重要的，因为TA自己调节rgets可能依赖于细胞功能。在疾病状态也很重要，以确定如何在miRNA表达的改变可能影响功能。
这里描述的方法的目标是建立在由Kloosterman 等 15，其他研究者16,17开发现有ISH方法，以及那些建议的Exiqon 1和优化方法对福尔马林固定的肾组织。我们已经成功地使用这种方法来确定单侧输尿管梗阻18在肾小分子RNA的miR-382的表达明显的地区差异。这种方法可以与其他组织可以用作良好，额外的优化。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文的目的是描述了miRNA的原位杂交协议，在福尔马林固定的肾组织效果很好。虽然制定这个协议染色神器的几个重要来源已经确定。仔细注意这几点可以帮助避免染色神器，增加成功的ISH执行的可能性。
可以发生一个染色神器的最可避免的原因时，组织切片成为在漫长的孵化干涸。当此发生时变成干燥的组织部分将NBT / BCIP发育（ 图1）中染色很暗。在本?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院赞助授予HL082798和HL111580。
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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