MicroRNA<em> In situ</em> Hybridisering for formalin Faste nyrevæv
Summary
Denne artikel beskriver en in situ hybridisering protokol optimeret til kolometriske detektion af microRNA udtryk i formalin faste nyresnit.
Abstract
I denne artikel beskriver vi en metode til kolorimetrisk detektion af miRNA i nyrerne gennem in situ hybridisering med digoxigenin tagged microRNA sonder. Denne protokol, der oprindeligt blev udviklet af Kloosterman og kolleger for bred anvendelse med Exiqon miRNA sonder 1, er blevet ændret til at overvinde udfordringer forbundet med miRNA-analyse i nyrevæv. Disse omfatter spørgsmål såsom identifikation struktur og svært at fjerne resterende sonde og antistof. Anvendelse af relativt tyndt, 5 mm tyk, vævssnit tilladt for klar visualisering af nyre-strukturer, mens en stærk sondesignal blev tilbageholdt i celler. Derudover blev probe koncentrations-og inkubationsbetingelser optimeret for at lette visualiseringen af microRNA udtryk med lav baggrund og uspecifik signal. Her er optimeret beskrevne protokol, der dækker den indledende væv indsamling og forberedelse gennem montering af glider ved slutningen af proceduren. Den grundlæggende componeNTS i denne protokol kan ændres til anvendelse til andre væv og cellekultur modeller.
Introduction
MicroRNA er små (ca. 22 nukleotider lange) noncoding RNA, der er endogent produceret. De fungerer generelt at undertrykke protein udtryk gennem translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning. miRNA binder til mRNA-mål med ufuldstændig komplementaritet, hvilket gør det muligt for en enkelt miRNA at undertrykke flere mål.
Forståelse som celletyper og strukturer udtrykker miRNA er en vigtig del af at forstå de mekanismer, hvorigennem ændringer i miRNA udtryk indflydelse celle og væv fænotyper. Mens metoder såsom miRNA sekventering, qPCR og Northern blotting kan anvendes til detektion af miRNA i hele væv, er denne fremgangsmåde ikke tillader en at bestemme, hvilken specifik celletype de kom fra inden for et givet væv. Dissektion af cellulære og strukturelle komponenter inden analyse ved hjælp af disse metoder kan være meget vanskeligt, og de betingelser, der er nødvendige for at opnå tilstrækkelige isolationer kan føre til alterations i genekspression eller forringelse af RNA. microRNA in situ hybridisering er en metode anvendt til at visualisere microRNA placering og ekspressionsniveauer i væv. Denne teknik er især værdifuldt i væv sammensat af heterogene strukturer, såsom nyrerne.
MicroRNAs har vist sig at spille en regulerende rolle i nyre-udvikling 2,3 og fysiologi 4. har også vist microRNA udtryk ændringer for at blive involveret med nedsat patologi såsom fibrose 5-10, diabetisk nefropati 7, nyrekarcinom 11,12 og akut nyreskade 13. I vores forskning har vi fundet, at en optimering microRNA in situ hybridisering for nyrevæv var værdifuldt for fastsættelse af det præcise strukturelle placeringer af miRNA-ekspression i både sundhed og sygdom 14. Bestemmelse af det rørformede og cellulære udtryk for forskellige microRNA er vigtigt, fordi deres regulering af targets kan være afhængig af cellulære funktioner. I sygdomstilstande er det også vigtigt at bestemme, hvordan ændringer i miRNA ekspression kan påvirke funktionen.
Målet med den her beskrevne fremgangsmåde var at bygge videre på eksisterende ISH metoder udviklet af Kloosterman et al. 15. andre efterforskere 16,17, og dem, der foreslås af Exiqon 1 og optimere metoden til formalin faste nyrevæv. Vi har med succes brugt denne metode til at identificere tydelige regionale forskelle i renal microRNA miR-382-ekspression med unilateral ureter obstruktion 18. Denne fremgangsmåde kan anvendes med andre væv samt, med yderligere optimering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne artikel var at beskrive en protokol for miRNA in situ hybridisering, der fungerer godt i formalin faste nyrevæv. Mens de arbejder ud denne protokol flere vigtige kilder til farvning artefakt er blevet identificeret. Omhyggelig opmærksomhed på disse punkter kan bidrage til at undgå pletter artefakt og øge sandsynligheden for en vellykket ISH løb.
En af de mest undgåelige årsager til farvning artefakt kan opstå, når vævssnit blevet tørret ud i lange inkuba…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud HL082798 og HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
