MikroRNA<em> In situ</em> Hybridisering for formalinfiksert Nyre Vev
Summary
Denne artikkelen beskriver en in situ hybridisering protokoll optimalisert for rimetrisk deteksjon av mikroRNA uttrykk i formalin faste nyre seksjoner.
Abstract
I denne artikkelen beskriver vi en fremgangsmåte for kolorimetrisk påvisning av miRNA i nyrene ved in situ hybridisering med merket Digoxigenin mikroRNA prober. Denne protokollen, opprinnelig utviklet av Kloosterman og kolleger for bred bruk med Exiqon miRNA sonder 1, har blitt modifisert for å overvinne utfordringene som ligger i miRNA analyse i nyre vev. Disse omfatter forhold som struktur identifisering og vanskelig å fjerne rester av probe og antistoff. Bruk av forholdsvis tynne, 5 mm tykt, vevssnitt tillatt for klar visualisering av nyrene konstruksjoner, mens en sterk probe signal ble holdt tilbake i cellene. I tillegg ble probe konsentrasjon og inkuberingsbetingelser optimaliseres for å lette visualiseringen av mikroRNA uttrykk med lav bakgrunn og ikke-spesifikk signal. Her blir optimalisert protokoll beskrevet, dekker den initielle vev innsamling og forberedelse gjennom montering av lysbilder ved slutten av prosedyren. Den grunnleggende components av denne protokollen kan bli endret for søknad til andre vev og cellekultur modeller.
Introduction
MikroRNA er liten (omtrent 22 nukleotider lang) noncoding RNAer som er endogent produsert. De vanligvis fungere å undertrykke protein uttrykk gjennom translasjonsforskning undertrykkelse eller mRNA degradering. mirnas binder seg til mRNA mål med ufullstendig komplementaritet, noe som gjør det mulig for en enkelt miRNA å undertrykke flere mål.
Forstå hvilke celletyper og strukturer uttrykke mirnas er en viktig del av å forstå mekanismene gjennom hvilke endringer i miRNA uttrykk innflytelse celle og vev fenotyper. Mens metoder som miRNA sekvensering, qPCR og Northern blotting kan benyttes for deteksjon av miRNAs i hele vev, gjør denne metoden ikke tillater en å bestemme hvilke spesifikke celletype de kom fra innenfor et gitt vev. Disseksjon av cellulære og konstruksjonsdeler før analyse ved hjelp av disse metoder kan det være svært vanskelig, og betingelsene for å oppnå tilstrekkelig isoleringer kan føre til alterations i genuttrykk eller degradering av RNA. mikroRNA in situ hybridisering er en metode som brukes for å visualisere mikroRNA plassering og uttrykk nivåer i vev. Denne teknikken er spesielt verdifullt i vev sammensatt av heterogene strukturer, slik som nyre.
MicroRNAs har vist seg å spille en regulerende rolle i nyre utvikling 2,3 og fysiologi fire. mikroRNA expression forandringer har også blitt vist å være involvert med renal patologi som fibrose 5-10, diabetisk nefropati 7, nyrekarsinom 11,12 og akutt nyre-skade 13. I vår forskning har vi funnet ut at å optimalisere mikroRNA in situ hybridisering for nyre vev var verdifull for å bestemme nøyaktig strukturelle steder av miRNA uttrykk i både helse og sykdom 14. Bestemmelse av den rørformede og cellulær ekspresjon av forskjellige microRNAs er viktig fordi deres regulering av TArgets kan være avhengig av cellulære funksjoner. I syke tilstander er det også viktig å finne ut hvordan endringer i miRNA uttrykk kan påvirke funksjonen.
Målet med metoden beskrevet her var å bygge på eksisterende ISH metoder utviklet av Kloosterman et al. 15, andre etterforskere 16,17, og de som foreslått av Exiqon en og optimalisere metoden for formalin faste nyre vev. Vi har med hell brukt denne metoden for å identifisere tydelige regionale forskjeller i nyre mikroRNA Mir-382 uttrykk med unilateral ureterobstruksjon 18. Denne tilnærmingen kan brukes sammen med andre vev også, med ytterligere optimalisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne artikkelen var å beskrive en protokoll for miRNA in situ hybridisering som fungerer godt i formalinfiksert nyre vev. Mens han jobbet ut denne protokollen flere viktige kilder til farging gjenstand har blitt identifisert. Nøye oppmerksomhet til disse punktene kan bidra til å unngå flekker artefakt og øke sannsynligheten for en vellykket ISH løp.
En av de mest unødvendige årsaker til farging artefakt kan oppstå når vevssnitt blir tørket ut under lange inkub…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institutes of Health gir HL082798 og HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
