MikroRNA<em> In situ</em> Hybridisering för formalinfixerad njurvävnad
Summary
I artikeln beskrivs en in situ hybridisering protokoll optimerat för colormetric upptäckt av mikroRNA uttryck i formalin fasta njursektioner.
Abstract
I denna artikel beskriver vi en metod för kolorimetrisk detektion av miRNA i njuren genom in situ hybridisering med digoxigenin märkt mikro-RNA-prober. Detta protokoll, som ursprungligen utvecklades av Kloosterman och kollegor för bred användning med Exiqon miRNA sonder 1, har modifierats för att övervinna utmaningar som miRNA analys i njurvävnad. Dessa inkluderar frågor som struktur identifiering och svårt att avlägsna rester sond och antikropp. Användning av relativt tunna, 5 mm tjock, vävnadssektioner som tillåts för tydlig visualisering av njurstrukturer, samtidigt som en stark sondsignal behölls i celler. Dessutom var sond koncentration och inkubationsförhållanden optimerade för att underlätta visualisering av mikroRNA uttryck med låg bakgrund och icke-specifik signal. Här är den optimerade protokollet beskrivet, som täcker den inledande insamlingen preparation av vävnader och genom montering av objektglasen vid slutet av förfarandet. Den grundläggande components av detta protokoll kan ändras vid tillämpningen på andra vävnader och cellkulturmodeller.
Introduction
MikroRNA är små (ca 22 nukleotider långa) icke-kodande RNA som endogent produceras. De fungerar i allmänhet att undertrycka proteinuttryck genom translationell förtryck eller mRNA nedbrytning. miRNA binder till mRNA-mål med ofullständig komplementaritet, vilket gör det möjligt för en enda miRNA för att undertrycka flera mål.
Förstå vilka typer och strukturer cell uttrycker miRNA är en viktig del i att förstå de mekanismer genom vilka förändringar i miRNA uttryck påverkar cell-och vävnads fenotyper. Även metoder som miRNA sekvensering, qPCR och Northern blotting kan användas för detektion av miRNA i hela vävnader, denna metod inte tillåter en att avgöra vilken specifik celltyp de kom inifrån en viss vävnad. Dissektion av cellulära och strukturella komponenter före analys med hjälp av dessa metoder kan vara mycket svårt och de villkor som behövs för att uppnå tillräckliga isoleringar kan leda till alterations i genuttryck eller nedbrytning av RNAs. mikro-RNA in situ hybridisering är en metod som används för att visualisera microRNAen lokalisering och expressionsnivåer i vävnader. Denna teknik är speciellt värdefull i vävnader som består av heterogena strukturer, såsom njuren.
MicroRNAs har visat sig spela en reglerande roll i njurutveckling 2,3 och fysiologi 4. mikroRNA uttryck förändringar har också visats vara involverad med njurpatologi såsom fibros 5-10, diabetesnefropati 7, njurkarcinom 11,12, och akut njurskada 13. I vår forskning har vi funnit att optimera mikroRNA in situ hybridisering för njurvävnad var värdefullt för att fastställa den exakta strukturella placeringen av miRNA uttryck i både hälsa och sjukdom 14. Bestämning av den rörformade och cellulär expression av olika microRNAs är viktigt eftersom deras reglering av TArgets kan vara beroende av cellulära funktioner. I sjukdomstillstånd är det också viktigt att avgöra hur förändringar i miRNA uttryck kan påverka funktionen.
Målet med den här beskrivna metoden var att bygga vidare på befintliga ISH metoder som utvecklats av Kloosterman et al. 15, andra utredare 16,17, och de som föreslås av Exiqon 1 och optimera metoden för formalin fasta njurvävnad. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att identifiera tydliga regionala skillnader i njur mikroRNA miR-382 uttryck med unilateral ureteral obstruktion 18. Denna metod kan användas med andra vävnader också, med ytterligare optimering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denna artikel var att beskriva ett protokoll för miRNA in situ hybridisering som fungerar bra i formalin fasta njurvävnad. Samtidigt tränar detta protokoll flera viktiga källor för färgning artefakt har identifierats. Noggrann uppmärksamhet på dessa punkter kan hjälpa till att undvika missfärgning artefakt och öka sannolikheten för en lyckad ISH körning.
En av de mest påverkbara orsaker till färgning artefakt kan uppstå när vävnadssnitt blir uttorkad und…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag HL082798 och HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
