Coltura e manutenzione<em> Clostridium difficile</em> In un ambiente anaerobico
Summary
Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.
Abstract
Clostridium difficile è un anaerobico, batteri sporigeni Gram-positivo che è principalmente responsabile della diarrea associata agli antibiotici (AAD) ed è un importante patogeno nosocomiale. C. difficile è notoriamente difficili da isolare e coltivare ed è estremamente sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell'ambiente. Qui, metodi per isolare C. difficile da campioni fecali e successivamente coltura C. difficile per la preparazione degli stock di glicerolo per la conservazione a lungo termine sono presentati. Sono anche descritte tecniche di preparazione e l'enumerazione scorte spore in laboratorio per una varietà di applicazioni a valle compresi studi di microscopia e animali. Queste tecniche richiedono una camera anaerobica, che mantiene un ambiente anaerobico coerente per garantire condizioni appropriate per ottimale C. la crescita difficile. Forniamo protocolli per il trasferimento di materiali e dalla camera senza cautilizzando una contaminazione significativa ossigeno insieme con suggerimenti per la manutenzione periodica necessaria per sostenere l'ambiente anaerobico adeguato per un efficiente e coerente C. la coltivazione difficile.
Introduction
Clostridium difficile è un batterio Gram-positivi, sporigeni batterio che è un anaerobio obbligato e un agente patogeno gastrointestinale potenzialmente fatale di uomini e animali. Inizialmente descritto nel 1935 come un organismo commensale trovato in campioni di feci da neonati 1, C. difficile è stato poi dimostrato di essere l'agente eziologico della colite pseudomembranosa associata a trattamento antibiotico 2. C. infezioni difficile (CDI) sono in genere preceduti da un trattamento antibiotico che provoca l'interruzione della normale flora del colon, creando una nicchia per C. difficile a prosperare 2. C. difficile è trasmesso come una spora dormiente via fecale-orale e successivamente germina all'interno del tratto gastrointestinale, producendo cellule vegetative in grado di generare più tossine e causando gravi malattie e colite 3. CDI sono spesso refrattari ai trattamenti convenzionali e questi infezioni sono spesso ricorrenti 4. Come risultato, CDI sono responsabili per un massimo di 4,8 miliardi dollari in spese sanitarie negli Stati Uniti 5-7.
C. difficile è molto sensibile anche bassi livelli di ossigeno nell'ambiente. Per C. difficile a persistere nell'ambiente e trasmettere in modo efficiente da un host all'altro, la formazione di una spora metabolicamente attivo è fondamentale 8. Poiché la manutenzione laboratorio e manipolazione di C. difficile richiede un ambiente anaerobico controllato, queste tecniche richiedono l'uso di una camera anaerobica. L'uso di camere anaerobiche ha aggravato recupero e l'isolamento di anaerobi obbligati 9-11, e ha permesso una serie di tecniche molecolari da eseguire in atmosfera anaerobica.
Oltre a C. difficile, l'uso della camera anaerobica e manutenzione qui descritti sono applicabiliad altri anaerobi obbligati come altre specie clostridi (ad esempio C. perfringens), altre specie gastrointestinali (ad esempio specie Bacteroides 12) e patogeni parodontali (ad esempio, specie Peptostreptococcus 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui descritti consentono il recupero semplice e veloce di C. difficile da una varietà di campioni fecali, compresi gli esseri umani, topi e criceti, nonché la conservazione a lungo termine di C. difficile come scorte glicerolo o spore. C. difficile può essere un organismo difficile da coltivare, ma accurata manutenzione di un ambiente anaerobico e l'applicazione di tecniche asettiche può provvedere robusta crescita e una riduzione della contaminazione.
<p class="jove_step"…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Coy Laboratori per fornire gentilmente le immagini della camera anaerobica. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione DK087763 (SMM) e un Curriculum STEP / HHMI Sviluppo Fellowship (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
- Hall, I. C., O’Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants – With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis – Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O’Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
