相互作用的研究<em>金黄色葡萄球菌</em与中性粒细胞通过流式细胞仪和时间推移显微镜

Summary

我们提出的方法来研究的PSM和其他分泌的毒素的效果<em>金黄色葡萄球菌</em>中性粒细胞，使用流式细胞仪和荧光显微镜。

Abstract

我们提出的方法来研究苯酚的可溶性modulins（PSM）的和其他毒素的金黄色葡萄球菌对中性粒细胞产生和分泌的效果。为了研究中性粒细胞的PSM隔离新鲜的中性粒细胞，采用密度梯度离心的效果。这些中性粒细胞钙动员后，荧光染料装入。激活中性粒细胞的PSM启动一个细胞内游离钙离子浓度的增加迅速而短暂的。在流式细胞仪实验，通过监视一个预载的荧光染料，反应的游离Ca ^{2 +}浓度的增加，可以测量这种快速动员。使用这种方法，我们可以判断的的PSM浓度要激活的嗜中性粒细胞，并测量具体和一般的嗜中性粒细胞活化的抑制剂的影响。

要探讨的PSM中的表达，在细胞内的空间，瓦特我们构建操纵PSMαGFP融合的推动者记者。当这些记者菌株的黄色葡萄球菌的中性粒细胞吞噬，诱导表达可以用荧光显微镜观察。

Introduction

中性粒细胞（中性粒细胞）是专业吞噬细胞发挥 ​​了关键作用，对金黄色葡萄球菌的先天免疫反应。主机和微生物之间不断的战斗已导致双方的军备竞赛。近日，社区相关（CA）株耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌 （MRSA）的出现，似乎是非常有效的规避中性粒细胞杀^2,3。过量的苯酚，水溶性modulin（PSM）的生产的CA-MRSA一直伴随着较高的毒力^4,5。人类嗜中性粒细胞能识别这些的PSM通过的FPR2导致活化的G蛋白偶联受体^6。最早的事件之一是动员细胞内储存的钙（Ca ^{2 +}的）。 Ca ^{2 +}的作用作为第二信使的效应子功能的各种中性粒细胞的脱颗粒和吞噬作用^7。因此的Ca ^{2 +}是一个非常敏感的指标的PSM激活中性粒细胞功能的能力。的PSM对中性粒细胞的影响进行研究，新鲜的嗜中性粒细胞分离和钙动员后，荧光染料装入。流式细胞仪在实验中，这种快速的动员可以衡量的。使用这种方法，可以研究对中性粒细胞的毒性和其它组件的直接影响，并确定这些活性的最低浓度。对于我们来说，这是一个非常有用的工具来研究许多蛋白质产生的效果由S.金黄色葡萄球菌参与免疫逃避，如的FPR2抑制蛋白^{（FLIPR）8，FLIPR}像^7，抑制趋化蛋白的金黄色葡萄球菌 （筹^）9。所有这些蛋白质已被证明能够抑​​制嗜中性粒细胞中钙的动员，通过结合受体识别激动剂。

最近，我们的组描述的PSM功能抑制血清脂蛋白^{10 <}/ SUP>。这些脂蛋白是大量存在于血液和人体组织，表明的PSM主要在细胞内环境中发挥其功能。钙动员检测的可用性允许激活中性粒细胞的PSM所表示的相当大的抑制血清中的浓度非常低，我们能够精确地测量血清脂蛋白的影响。

的PSM功能抑制血清中，我们假设，作为细胞内毒素的PSM是一个重要的功能。因此，我们试图确定后吞噬作用的PSM。要调查的PSM间隙的表达，我们已经建立了记者操纵psmαGFP融合的推动者。当这些记者菌株的的中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌 ，观察到诱导表达用荧光显微镜^10。显然，这样的构造共鸣装置允许大量的在S基因的表达研究后吞噬金黄色葡萄球菌或其他病原体。由于为S。间利基尚存在金黄色葡萄球菌是非常重要的是要克服先天免疫系统的^{11 10 12，}在这个利基激活的基因的作用研究，以了解其毒力是高度相关的。

Protocol

1。从人体血液中的中性粒细胞密度离心分离抽取5毫升管静脉血肝素。 准备双层聚蔗糖梯度（4梯度为5管血）如下：倒入12毫升的密度1.119克/毫升在50毫升管中的聚蔗糖溶液中，并小心地层10毫升的密度1.077克/毫升的聚蔗糖溶液的顶部。 用等体积的PBS中，稀释血液。 层仔细双层聚蔗糖梯度稀释血液; 20-25毫升，每梯度。 以396×g离心20分钟，一个吊桶转子，22°C无制?…

Representative Results

流式细胞仪检测评估钙动员人体中性粒细胞孵化产生的合成PSMα3的钙离子流的增加在FL-1中的信号，这是显示所测得的快速激活的嗜中性粒细胞的浓度系列。预孵育合成PSMα3与0.01％，0.1％或1％人血清显着抑制的能力引起的钙通量（ 图1）。 中性粒细胞吞噬后在细菌中表达的GFP荧光显微镜分析吞噬细菌含有PSMαGFP记者10日</sup…

Discussion

在这里描述的方法中，一些步骤是非常关键的。我们将突出这些在这里。

如果在中性粒细胞通过密度梯度离心的分离，重要的是离心步骤期间或之后，为了不妨碍层。当使用塑料吸管吸嗜中性粒细胞，确保不要挤气球，而在细胞层，喷射液体会扰乱层。另外，目视检查后中性粒细胞颗粒渗透冲击和离心步骤。如果沉淀仍然是红色的红细胞裂解并不足够有效的，应再重复一次?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process