זיהוי אופטי של<em> א coli</em> חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous
Summary
Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).
Abstract
Biosensor אופטי ללא תווית המבוסס על Si הנקבובי nanostructured מיועד ללכידה וזיהוי מהירים של חיידקי Escherichia coli K12, כמיקרואורגניזם מודל. Biosensor מסתמך על כריכה ישירה של תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו, בעוד שאף טיפול מקדים (למשל על ידי תמוגה תא) של המדגם למד נדרשת. סרט דק Si mesoporous משמש כאלמנט מתמר האופטי של biosensor. תחת תאורת אור לבנה, השכבה נקבובית מציגה דפוסי שוליים פברי פרו-נפתרו היטב בספקטרום רפלקטיביות שלה. החלת Fast Fourier Transform (FFT) לתוצאות נתוני רפלקטיביות בשיא אחד. שינויים בעוצמת שיא FFT נמצאים תחת פיקוח. לפיכך, חיידקי היעד ללכוד על גבי משטח biosensor, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, גורם לשינויים מדידים באינטנסיביות של פסגות FFT, המאפשרים תצפית "בזמן אמת" של קובץ מצורף חיידקים.
NT "> סרט Si mesoporous, מיוצר על ידי תהליך anodization אלקטרוכימיים, הוא מצומדת עם נוגדנים חד שבטיים, ספציפיים לחיידקי היעד. חוסר התנועה, immunoactivity והספציפיות של הנוגדנים אושר על ידי ניסויי תיוג ניאון. רגע biosensor חשוף ל חיידקי יעד, התאים שנתפסו ישירות על גבי משטח Si הנקבובי-הותאם נוגדן. אירועי לכידה ספציפיים אלה לגרום לשינויים בעוצמה בספקטרום ההפרעות אופטיות סרט דק של biosensor. אנו מדגימים כי biosensors אלה יכולים לזהות ריכוזי חיידקים נמוכים יחסית (זיהוי מגבלה של 10 4 תאים / מיליליטר) בפחות משעה.Introduction
מוקדם ומדויק זיהוי של חיידקים פתוגניים הוא חשוב ביותר עבור מזון ובטיחות מים, ניטור סביבתי, ואבחון נקודה של טיפול 1. כמו טכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות הן זמן רב, מייגע, ואין להם את היכולת לזהות מיקרואורגניזמים ב" בזמן אמת ", או מחוץ לסביבת המעבדה, biosensors מתפתח כדי לעמוד באתגרים אלה 2-5.
בשנים האחרונות, סי נקבובית (PSI) התפתחה כפלטפורמה מבטיחה לעיצוב של חיישנים וbiosensors 6-20. בעשור האחרון מחקרים רבים בנוגע לחיישנים אופטיים המבוסס על PSI וbiosensors פורסמו 21,22. שכבת PSI nanostructured היא מפוברק בדרך כלל על ידי תחריט anodic אלקטרוכימיים מSi רקיק יחיד גביש. ננו PSI כתוצאה תערוכה רבים מאפייני יתרון, כגון פנים גדול ונפח חופשי, להתעמק בגדלים שניתן לשלוט וopti מתכונןמאפייני קאל 10,16. התכונות אופטיות של שכבת PSI, כגון photoluminescence 8,11 ואינטרפרומטריה מבוססת החזרה אור הלבן 7,19, מושפעות במידה רבה על ידי תנאים סביבתיים. לכידתו של analytes מולקולות / יעד אורחים בתוך תוצאות השכבה נקבוביות בשינוי במקדם השבירה הממוצעת של הסרט, כפי שנצפה אפנון בספקטרום photoluminescence או כשינוי באורך גל בספקטרום רפלקטיביות 10.
למרות החדשנות העצומה בתחום טכנולוגית biosensor האופטי PSI, יש רק כמה דיווחים על פלטפורמות מבוססות PSI לגילוי חיידקים 6,8,20,23-29. בנוסף, רוב מחקרי הוכחה של קונספט אלה הוכיחו זיהוי "עקיף" חיידקים. לכן, בדרך כלל תמוגה המוקדמת של התאים נדרשת כדי לחלץ את שברי החלבון / DNA הממוקד, אופייניים לחיידקים למדו 29. הגישה שלנו היא ללכוד ישירות חיידקי היעדתאים על גבי biosensor PSI. לפיכך, נוגדנים חד שבטיים, שהם ספציפיים כדי למקד חיידקים, הם משותקים על פני השטח הנקבובי. כריכה של תאי חיידקים, דרך אינטראקציות נוגדן אנטיגן, על פני השטח של biosensor לגרום לשינויים באמפליטודה (עוצמה) של ספקטרום רפלקטיביות 24-26.
בעבודה זו, אנו מדווחים על הבנייה של biosensor מבוסס PSI אופטי ולהדגים היישום שלה כפלטפורמת biosensing ללא תווית לזיהוי של Escherichia coli (E. coli) חיידקי K12 (המשמשים כמודל מיקרואורגניזם). פיקוח אות אופטי הוא האור מוחזר מnanostructure psi עקב ההפרעה פברי פרו-סרט דק (איור 1 א). שינויים במשרעת / עוצמת האור מתואמים לקיבוע מסוים של תאי חיידקי היעד על גבי משטח biosensor, המאפשרים איתור וכימות של החיידקים מהירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunosensor אופטי ללא תווית, המבוסס על nanostructure PSiO 2 (סרט דק פברי פרו-) הוא מפוברק, ותחולתה הפוטנציאלית כbiosensor לגילוי חיידקים הוא אישרה.
שינויים ופתרון בעיות
אחד החששות הגדולים בעת תכנון immunosensor ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס 1118-1108 ומענק מס 1146-1112) ומינה קרול זיכרון קרן המחקר. ES מכיר בהכרת תודה על התמיכה הכספית של ראסל ברי למכון.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
References
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
