Detección óptica de<em> E. coli</em> Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores
Summary
Se introduce un biosensor óptico libre de marca para la detección de bacterias rápidos. El biosensor se basa en una Si poroso nanoestructurado, que está diseñado para capturar directamente las células de las bacterias diana sobre su superficie. Utilizamos anticuerpos monoclonales, inmovilizados sobre el transductor porosa, como las sondas de captura. Nuestros estudios demuestran la aplicabilidad de estos biosensores para la detección de concentraciones bacterianas bajas dentro de minutos sin procesamiento de la muestra antes (tales como la lisis celular).
Abstract
Un biosensor óptico libre de etiquetas basado en un nanoestructurado Si poroso está diseñado para la captura rápida y la detección de bacterias de Escherichia coli K12, como un modelo de microorganismo. El biosensor se basa en la unión directa de las células de las bacterias diana sobre su superficie, mientras que no se requiere ningún tratamiento previo (por ejemplo, mediante la lisis celular) de la muestra estudiada. Una película delgada de Si mesoporoso se utiliza como el elemento transductor óptico del biosensor. Bajo iluminación de luz blanca, la capa porosa muestra patrones de franjas de Fabry-Perot bien resueltas en su espectro de reflectividad. La aplicación de una transformada rápida de Fourier (FFT) a los resultados de datos de reflectividad en un solo pico. Los cambios en la intensidad del pico de FFT son monitoreados. Por lo tanto, bacterias diana capturan sobre la superficie del biosensor, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, induce cambios mensurables en la intensidad de los picos de FFT, lo que permite una observación "tiempo real" de unión bacterias.
NT "> La película mesoporosa de Si, fabricado por un proceso de anodización electroquímica, se conjuga con anticuerpos monoclonales, específicos para las bacterias diana. La inmovilización, actividad inmunológica y especificidad de los anticuerpos son confirmados por experimentos de marcaje fluorescente. Una vez que el biosensor está expuesto a la bacterias diana, las células son capturados directamente sobre la superficie porosa de Si-anticuerpo modificado. Estos eventos de captura específicas resultan en cambios de intensidad en el espectro de interferencia óptica de película delgada del biosensor. Se demuestra que estos biosensores pueden detectar concentraciones de bacterias relativamente bajas (detección límite de 10 4 células / ml) en menos de una hora.Introduction
Temprana y precisa identificación de bacterias patógenas es extremadamente importante para la alimentación y la seguridad del agua, monitoreo ambiental, y el punto de atención de diagnóstico 1. Como las técnicas tradicionales de microbiología son lentos, laboriosos, y carecen de la capacidad para detectar microorganismos en "tiempo real" o fuera del entorno de laboratorio, los biosensores están evolucionando para responder a estos desafíos 2-5.
En los últimos años, Si poroso (PSI) se ha convertido en una plataforma prometedora para el diseño de sensores y biosensores 6-20. Durante la última década numerosos estudios sobre los sensores y biosensores ópticos basados en la ISP fueron publicados 21,22. La capa PSi nanoestructurado se fabrica típicamente por grabado electroquímico anódica a partir de un solo cristal de la oblea de Si. Los nanomateriales PSi resultantes exhiben muchas características ventajosas, como la gran superficie y volumen libre, tamaños de poro que se pueden controlar y opti sintonizablepropiedades cal 10,16. Las propiedades ópticas de la capa PSi, como fotoluminiscencia 8,11 y la luz blanca a base de reflectancia interferometría 7,19, están fuertemente influenciadas por las condiciones ambientales. Captura de los huéspedes analitos moléculas / objetivo dentro de los resultados capa porosa en un cambio en el índice de refracción promedio de la película, observado como una modulación en el espectro de fotoluminiscencia o como un cambio de longitud de onda en el espectro de reflectividad 10.
Aunque la gran innovación en tecnología de biosensor óptico PSi, sólo hay pocos informes sobre plataformas basadas en psi para la detección de bacterias 6,8,20,23-29. Además, la mayoría de estos estudios de prueba de concepto han demostrado "indirecta" de detección de bacterias. Por lo tanto, se requiere la lisis generalmente antes de las células para extraer los fragmentos de proteína / ADN dirigidos, característicos de las bacterias estudiadas 29. Nuestro enfoque es capturar directamente las bacterias dianacélulas sobre el biosensor psi. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales, que son específicos para las bacterias diana, se inmovilizan sobre la superficie porosa. La unión de células de las bacterias, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, sobre la superficie del biosensor inducir cambios en la amplitud (intensidad) de la espectro de reflectividad 24-26.
En este trabajo, nos informe sobre la construcción de un biosensor basado en PSi óptica y demostrar su aplicación como una plataforma de biosensores sin etiqueta para la detección de Escherichia coli (E. coli) K12 (utilizado como modelo de microorganismos). El monitoreado señal óptica es la luz reflejada desde el nanoestructura PSi debido a Fabry-Perot de interferencia de película delgada (Figura 1A). Los cambios en la luz de amplitud / intensidad se correlacionan a la inmovilización específica de las células de las bacterias diana sobre la superficie del biosensor, lo que permite la rápida detección y cuantificación de las bacterias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un inmunosensor óptica-etiqueta libre, basado en un PSIO 2 nanoestructura (una película delgada de Fabry-Perot) se fabrica, y su aplicabilidad potencial como un biosensor para la detección de bacterias se confirma.
Modificaciones y solución de problemas
Una de las principales preocupaciones cuando se diseña un inmunosensor es la susceptibilidad de los anticuerpos a someterse a cambios de conformación no deseados durante la deposición y el patrón s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel (subvención N º 1118/08 y la concesión N º 1146/12) y el Fondo de Investigación Conmemorativo Kroll Minna. ES agradece el apoyo financiero del Instituto de Nanotecnología Russell Berrie.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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