Meting van totale Calcium in Neuronen door Electron Probe X-stralen micro analyse

Summary

Dit artikel beschrijft de toepassing van cryoanalytical elektronenmicroscopie aan de kwantitatieve meting van het totale gehalte aan calcium en distributie op subcellulaire resolutie in fysiologisch gedefinieerde biologische monsters.

Abstract

In dit artikel de tools, technieken en instrumenten die geschikt is voor kwantitatieve metingen van intracellulaire elementaire inhoud met behulp van de techniek die bekend staat als elektronen probe micro analyse (EPMA) worden beschreven. Intramitochondriale calcium is bijzondere aandacht vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve aandoeningen. De methode is gebaseerd op de analyse van röntgenstralen opgewekt in een elektronenmicroscoop (EM) door interactie van een elektronenbundel het model. Om de natieve verdeling van diffundeerbare elementen elektronenmicroscopie specimens behouden EPMA vereist "Cryofixatie" weefsel gevolgd door de bereiding van ultradunne vriescoupes. Snel invriezen van gekweekte cellen of organotypische slice culturen wordt uitgevoerd door duik invriezen in vloeibaar ethaan of door slam bevriezing tegen een koude metalen blok, respectievelijk uitgevoerd. Cryosecties nominaal 80 nm dik zijn droog gesneden met een diamant mes op ca.. -16076, C, gemonteerd op koolstof /-pioloform gecoate koperen roosters, en cryotransferred in een cryo-EM behulp van een gespecialiseerde cryospecimen houder. Na visueel onderzoek en locatie mapping op ≤ -160 ° C en lage dosis elektronen, bevroren gehydrateerd vriescoupes gevriesdroogd bij -100 ° C voor ~ 30 minuten. Organel-niveau afbeeldingen gedroogde vriescoupes worden geregistreerd, zelfs bij lage doses, door een langzame scan CCD camera en subcellulaire regio's geselecteerd voor analyse belang. Röntgenstralen uitgezonden door ROI door een stationaire, gerichte hoge intensiteit elektronen probe worden verzameld door een energie-dispersieve röntgen (EDX) spectrometer, verwerkt door bijbehorende elektronica en gepresenteerd als een X-ray spectrum, dat wil zeggen een perceel van X-ray intensiteit versus energie. Extra software vergemakkelijkt: 1) identificatie van elementaire componenten door hun "kenmerkende" piek energieën en vingerafdrukken, en 2) kwantitatieve analyse door extractie van piekgebieden / achtergrond. Dit artikel sluit af met twee voorbeelden die typisch illustrerenEPMA toepassingen, een waarin mitochondriale calcium analyse die kritisch inzicht in mechanismen van excitotoxische letsel en een andere die de basis van ischemie weerstand onthuld.

Introduction

Calciumionen zijn misschien wel de belangrijkste en meest veelzijdige cell signaling entiteit in de biologie, spelen een essentiële rol in normale processen zo divers als synaptische transmissie en genexpressie. Anderzijds, calcium is even belangrijk in celdood. In het bijzonder calcium deregulering is een belangrijke factor in neuronale schade beroerte, Parkinson, Alzheimer en andere neurodegeneratieve aandoeningen ^3,5. Het is dus uiterst belangrijk om kwantitatief te begrijpen hoe calcium is verdeeld in cellen en hoe dit verandert na fysiologische of pathofysiologische stimuli. Dit doel wordt gecompliceerd door het feit dat calcium dynamisch verdeeld tussen twee fysieke toestanden – vrij in oplossing of gebonden aan een substraat – en die cellulaire calciumconcentraties veranderen verscheidene orden van grootte als gevolg van stimulatie.

Hoewel er verschillende geavanceerde methoden beschikbaar voor de analyse van free intracellulair calcium, is het totale gehalte aan calcium concentraties in bepaalde intracellulaire compartimenten realistisch beperkt tot een benadering, namelijk elektronen probe microanalyse (EPMA). EPMA is een techniek die paren een röntgenspectrometer een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). De TEM elektronenkanon richt een stationaire, submicron elektronen probe op een subcellulaire gebied van belang en het element-specifieke röntgenstraling als gevolg van elektronen bombardement worden verzameld en geanalyseerd (zie referenties ^{7, 4} voor gedetailleerde technische beoordelingen). Voordelen van EPMA omvatten enkel organel-niveau resolutie en submillimolar gevoeligheid. In de praktijk echter, EPMA vereist gespecialiseerde cryotechniques en instrumentatie voor het prepareren en analyseren. Hier, de tools, technieken en instrumenten geschikt zijn voor metingen van intracellulair calcium gebruik EPMA worden beschreven. Intramitochondriële calcium is van speciale iBELANG vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve ziekten.

Protocol

De hier beschreven aanpak is ontwikkeld met behulp van specifieke instrumenten, tools en software. Omdat labs niet zal worden met dezelfde experimentele opstelling de aanpak wordt gegeneraliseerd waar mogelijk. 1. Snel invriezen De analytische methode beschreven is geheel afhankelijk cryogene benaderingen: 1) de "Cryofixatie" cellen of weefsels op een manier die kwantitatief behoudt de verdeling van diffundeerbare weefselcomponenten en chemische elementen…

Representative Results

Hersencellen typisch ondersteunen excitotoxische schade als gevolg van de pathologische neurotransmitters die optreedt onder ischemische omstandigheden. EPMA was van cruciaal belang om te ontdekken hoe het vermogen van neuronale mitochondriën om enorme hoeveelheden calcium afzonderen ten grondslag ligt aan het mechanisme van de schade. De elektronenmicroscoop figuur 3 illustreert de verschijning van mitochondriën in gevriesdroogde cryosecties gekweekte hippocampale neuronen na 30 minuten blootstelling…

Discussion

De elektronen microscoop gebaseerde analytische methode hier gepresenteerde maakt de detectie, identificatie en kwantificering van verscheidene elementen van biologisch belang, zoals Na, K, P, vooral Ca. Deze analyses kunnen op subcellulaire worden uitgevoerd, dat wil zeggen, intra-organel, resolutie als gevolg van de mogelijkheid om te lokaliseren en structuren van belang bij hoge-kwaliteit beelden van cryosecties bereid uit snel ingevroren monsters te identificeren. Merk op dat er geen kleuring nodig is om el…

Materials

			REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
			EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
			The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)