Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l'hippocampe

Summary

précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.

Abstract

précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.

Introduction

Neurones primaires sont l'un des types cellulaires les plus difficiles à transfecter car ils sont post-mitotiques et sont très sensibles aux changements des micro-environnement. Il existe quatre types de méthodes pour l'expression de gènes exogènes et ARN court en épingle à cheveux (shRNA) dans ces cellules ^une couramment utilisés. Chacun a ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, l'électroporation est généralement effectuée sur les neurones fraîchement isolés ^2, les cellules doivent être transférés dans des cuvettes pour la transfection. infection par le virus peut généralement atteindre un rendement très élevé ^3, mais il est plus de main-d'œuvre et risqué pour les opérateurs. Beaucoup de réactifs de transfection médiée par un lipide sont disponibles dans le commerce, avec des degrés variables de succès dans les neurones et les différents niveaux de cytotoxicité.

la transfection au phosphate de calcium représente une méthode pratique et économique pour l'introduction de gènes étrangers dans les neurones. La méthode a été utilisée pour la première à introduire de l'ADN de l'adénovirus dans cel mammifèresls par Graham et Van Der Eb (1973) ^4. La transfection a été réalisée en mélangeant du chlorure de calcium avec de l'ADN recombinant dans un tampon de phosphate. Ceci permet la formation de phosphate de l'ADN / de calcium précipite, qui, en cas de chute progressivement sur ​​une monocouche de cellules, d'adhérer à la surface de la cellule, sont repris par endocytose et finalement pénétrer dans le noyau ^5. Ce processus conduirait à l'expression de gènes étrangers introduits dans la cellule cible. Efficacité typiques de calcium gamme de transfection de phosphate entre 0,5-5% ^6-8. Cependant, avec une optimisation soigneuse et constante de l'exécution du protocole expérimental, il est possible d'atteindre une efficacité de transfection de près de 50%. Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la transfection au phosphate de calcium de neurones hippocampiques primaires, qui sont co-cultivées avec des cellules astrogliales dans un format en sandwich ^9.

Protocol

Une. Préparation Rat Astrocyte Culture pour les milieux conditionnés et astrocyte-neurone co-cultures. Préparer dissection tampon (BSS, voir le tableau 1 pour la recette) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Anesthésier les ratons nouveau-nés (P0-P2) avec de l'isoflurane dans un bécher de 500 ml. Lorsque les chiots sont immobiles, pulvériser avec 70% d'éthanol et décapiter. Retirez le cerveau. Tenez fermement la tête avec un…

Representative Results

Lorsque les différents paramètres de transfection sont optimisés et contrôlés soigneusement de expérience à l'autre, il est possible d'obtenir des efficacités de transfection allant jusqu'à 50%. Figure 1 montre un domaine de neurones qui sont transfectées avec la GFP sur DIV4. Le champ contient un total de 28 neurones, parmi lesquels 16 ont été transfectées. Cela représente un rendement de plus de 50%. Un échantillon des autres champs de la même lamelle montre le rendement gl…

Discussion

Il ya plusieurs paramètres clés qui doivent être soigneusement contrôlée pour transfections toujours réussies ^10,11. Le paramètre le plus critique pour la transfection au phosphate de calcium est la valeur de pH de 2 x HBS, qui dans nos mains varie habituellement entre 7.10 à 7.15. Nous vous conseillons d'effectuer trois lots de stocks avec des valeurs de pH par pas de 0,05 pour tenir compte de la différence entre les pH-mètres. Autrement, le kit de transfection mammifère Clontech fournit 2x HB…

Materials

Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375