Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l'effet de l'infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Résumé

Cette méthode décrit l'utilisation de la chimie clic pour mesurer les changements dans la transcription de la cellule hôte après infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12. Les résultats peuvent être visualisés qualitativement par microscopie à fluorescence ou obtenus quantitativement par cytométrie de flux. Cette méthode est adaptable pour une utilisation avec d'autres virus.

Résumé

De nombreux virus à ARN ont développé la capacité à inhiber la transcription de la cellule hôte comme un moyen de contourner les défenses cellulaires. Pour l'étude de ces virus, il est donc important de disposer d'un moyen rapide et fiable de mesure de l'activité transcriptionnelle dans les cellules infectées. Traditionnellement, la transcription a été mesurée soit par incorporation de nucléosides radioactifs tels que ^3H-uridine suivie d'une détection par autoradiographie ou comptage à scintillation, ou l'incorporation d'uridine halogénés analogues tels que le 5-bromouridine (BRU) suivie d'une détection par coloration immunologique. L'utilisation d'isotopes radioactifs, cependant, nécessite un équipement spécialisé et n'est pas réalisable dans un certain nombre de paramètres de laboratoire, tandis que la détection de BrU peut être lourde et peut souffrir d'une faible sensibilité.

La chimie de clic récemment mis au point, ce qui implique une formation de triazole cuivre catalysée par un azoture et un alcyne, offre maintenant une rapide et highly alternatif sensibles à ces deux méthodes. Cliquez chimie est un processus en deux étapes dans lequel ARN naissant est d'abord marquées par incorporation de l'uridine analogique 5 éthynyluridine (UE), suivie par la détection de l'étiquette avec un azoture fluorescent. Ces azides sont disponibles en plusieurs fluorophores différents, ce qui permet un large éventail d'options pour la visualisation.

Ce protocole décrit une méthode permettant de mesurer la répression de la transcription dans les cellules infectées par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (FVR) souche MP-12 à l'aide click chemistry. Parallèlement, l'expression de protéines virales dans ces cellules est déterminé par immunomarquage intracellulaire classique. Les étapes 1 à 4 en détail une méthode pour visualiser la répression de la transcription par microscopie à fluorescence, tandis que les étapes 5 à 8 détaillent une méthode pour quantifier la répression de la transcription par cytométrie de flux. Ce protocole est facilement adaptable pour une utilisation avec d'autres virus.

Introduction

Traditionnellement, l'activité transcriptionnelle a été mesurée par incorporation de deux radioactif ⁽³ H-uridine) ou ¹ (BRU) ² nucléosides halogénés en ARN naissants. Ces analogues d'uridine sont prises par les cellules, convertis en uridine triphosphate (UTP) à travers la voie de récupération nucléosidique, et par la suite incorporés dans l'ARN nouvellement synthétisé. ^3H-uridine peuvent être détectés par autoradiographie, ce qui peut prendre beaucoup de temps, ou scintillation comptage, qui nécessite un équipement spécialisé. En outre, l'utilisation d'isotopes radioactifs ne peut être pratique d....

Protocole

Analyse de la transcription par microscopie à fluorescence

1. Infecter les cellules avec MP-12 et étiquettes ARN naissant avec l'UE

1. Placer les lamelles rondes de 12 mm dans la plaque de culture tissulaire à 12 puits, une lamelle par puits.

Note: Si les cellules ont du mal à adhérer à lamelles, manteau avec de la poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) avant de le placer dans les puits. Dans ce but, des lamelles de plonger dans une solution mg / ml stérile à 0,1 en H ₂ O de poly-L-lysine pendant 5 min. Rincer lamelles avec H ₂ O stérile et sécher à l'air pendant ....

Résultats

La protéine NS du RVFV (famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus) ¹¹ inhibe la cellule hôte transcription général à travers deux mécanismes distincts: (i) en séquestrant la sous-unité p44 du facteur de transcription basal TFIIH ¹¹ et (ii) en favorisant la dégradation par le protéasome de la p62 sous-unité de TFIIH ^6. La souche vaccinale RVFV MP-12 ¹³ a été utilisé pour les expériences décrites dans ce protocole depuis souche MP-12 peut être manipulé dans u.......

Discussion

Le protocole fourni décrit une méthode pour mesurer l'effet de l'infection virale sur la transcription de la cellule hôte via l'incorporation de l'uridine analogique UE en ARN naissants. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes: il est rapide, sensible et il ne repose pas sur l'utilisation des isotopes radioactifs. En outre, le procédé peut être adapté pour fournir des données qualitatives par microscopie à fluorescence ou des données quantitatives par cytométri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-éthynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissoudre dans du DMSO pour 100 mM stock 12
mm rond lamelles	Fisherbrand	12-545-82
5 ml tubes en polystyrène	BD Biosciences	352058
Actinomycine D (ActD)	Sigma	9415	dissoudre dans du DMSO pour 10 mM stock
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG	Invitrogen	A-11029
Albumine sérique bovine (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissoudre dans H2O pour 100 mM de stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissoudre dans H2O pour 5 mg/ml de
stock DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Azoture fluorescent Invitrogen	16000044
(couplé à Alexa Fluor 594)	Azoture fluorescent Invitrogen	A10270
(couplé à Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Acide L-ascorbique	Sigma	A-5960	à dissoudre dans H2O pendant 500 mM
filtre en papier	VWRbrand	28333-087
paraformaldéhyde	Sigma	158127
Pénicilline-Streptomycine	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ ; 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissoudre dans H2O pour un stock de 1,5 M, pH 8,5
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056
Microscope			par exemple Cytomètre
			par exemple BD Biosciences LSRII Fortessa

à fluorescence en flux Olympus IX71