Ved hjelp Klikk kjemi å måle effekten av virusinfeksjon på Host-Cell RNA syntese
Summary
Denne fremgangsmåte beskriver bruken av klikk-kjemi for å måle endringer i vertscelle transkripsjon etter infeksjon med Rift Valley-feber-virus (RVFV) stamme MP-12. Resultatene kan visualiseres kvalitativt via fluorescens mikroskopi eller innhentet kvantitativt gjennom flowcytometri. Denne fremgangsmåte kan tilpasses for bruk med andre virus.
Abstract
Mange av RNA-virus har utviklet evne til å inhibere vertscelle transkripsjon som et middel for å omgå cellulære forsvarsmekanismer. For studiet av disse virusene, er det derfor viktig å ha en rask og pålitelig måte å måle transkripsjonell aktivitet i infiserte celler. Tradisjonelt har transkripsjon blitt målt enten ved inkorporering av radioaktive nukleosider såsom 3H-uridin etterfulgt av deteksjon via autoradiografi eller scintillasjonstelling, eller inkorporering av halogenerte uridine analoger såsom 5-bromouridine (BRU) etterfulgt av deteksjon via farging. Bruken av radioaktive isotoper, men krever spesialutstyr og er ikke gjennomførbart i et antall laboratorie-innstilling, og påvisning av BRU kan være brysom og kan lide av lav sensitivitet.
Den nylig utviklede klikk kjemi, som innebærer en kobber-katalysert triazole formasjon fra en azide og en alkyne, nå gir en rask og highly følsom alternativ til disse to metodene. Klikk kjemi er en to-trinns prosess i hvilken begynnende RNA er først merkes ved innlemmelse av uridin analogt 5-ethynyluridine (EU), etterfulgt av påvisning av merkingen med en fluorescerende azid. Disse azider er tilgjengelig som flere forskjellige fluorophores, noe som åpner for et bredt spekter av muligheter for visualisering.
Denne protokollen beskriver en metode for å måle transkripsjonell undertrykkelse i celler infisert med Rift Valley fever virus (RVFV) stamme MP-12 bruker klikk kjemi. Samtidig er ekspresjon av virale proteiner i disse cellene bestemmes ved klassisk intracellulær farging. Trinn 1 til 4 detalj en metode for å visualisere transkripsjonell undertrykkelse via fluorescens mikroskopi, mens trinn 5 til 8 detalj en metode for å kvantifisere transkripsjonell undertrykkelse via flowcytometri. Denne protokollen er lett tilpasses for bruk med andre virus.
Introduction
Tradisjonelt har transkripsjonell aktiviteten blitt målt gjennom inkorporering av enten radioaktivt (3 H-uridin) en eller halogenerte (BRU) 2 nukleosidene i begynnende RNA. Disse uridine analoger blir tatt opp av celler, omdannes til uridin-trifosfat (UTP) gjennom nukleosid salvage pathway, og deretter inkorporert i nylig syntetiserte RNA. 3H-uridin kan påvises ved autoradiografi, som kan være tidkrevende, eller scintillation telling, noe som krever spesialisert utstyr. Videre kan anvendelse av radioaktive isotoper som ikke være praktisk i en rekke laboratoriet, inkludert høy inneslutning biosikkerhet laboratorier. Bru kan oppdages gjennom farging med anti-BRU antistoffer, som kan kreve sterke permeabilization å sikre tilgang av antistoffet til kjernen eller delvis denaturering av RNA, RNA sekundær struktur som kan være en sterisk hindring for antistoffbinding.
_content "> Protokollen er beskrevet her benytter den nylig utviklede klikk kjemi tre for å måle transkripsjonell aktivitet i celler infisert med RVFV belastning MP-12. Klikk kjemi er avhengig av en svært selektiv og effektiv kobber (I)-katalysert cycloaddition reaksjon mellom en alkyne og et azid moiety 4,5. På denne protokollen, er begynnende RNA i infiserte celler først merkes ved inkorporering av den uridin analogt EU. I et andre trinn blir det innarbeidet EU oppdages gjennom omsetning med et fluorescerende azid. Hovedfordelene ved denne fremgangsmåte er (1) at den ikke krever bruk av radioaktive isotoper, og (2) at den ikke krever harde permeabilization eller denaturering av RNA. med en molekylvekt på mindre enn 50 Da, tilgang av fluorescerende azid dette ikke hindres av utilstrekkelig permeabilization eller RNA sekundær struktur. Videre er forskere ikke begrenset i valg av primære antistoffer ved kombinasjon av påvisning av RNA med en klasseical farging for viral proteiner.To ulike metoder er beskrevet i denne protokollen: ett for å visualisere transkripsjon via fluorescens mikroskopi (trinn 1-4), og ett for å kvantifisere transkripsjon gjennom flowcytometri (trinn 5-8). Begge disse metodene kombinerer merking av begynnende RNA med en intracellulær farging for viral proteiner, som gjør det mulig for en sammenheng mellom transcriptional aktivitet og virusinfeksjon på en celle-by-celle basis.
Forfatterne har med hell brukt protokollen beskrevet her for å finne ut transkripsjonell aktivitet i celler infisert med RVFV belastning MP-12 6, celler infisert med forskjellige MP-12 mutanter 7,8, 9 og celler infisert med Toscana virus (TOSV) 10. Protokollen er beskrevet her kan enkelt tilpasses for bruk med ulike virus, og har potensial til å bli endret til å omfatte immunfluorescens farging av spesifikke virus eller mobilnettet proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den angitte protokoll beskriver en metode for å måle effekten av viral infeksjon på vertscelle transkripsjon gjennom innlemmelse av uridin analogt EU til begynnende RNA. Denne metode har flere fordeler fremfor tidligere metoder: den er rask, sensitiv, og det ikke er avhengig av anvendelse av radioaktive isotoper. Videre kan metoden tilpasses for å gi kvalitative data gjennom fluorescensmikroskopi eller kvantitative data via strømningscytometri ved bruk av hovedsakelig de samme reagenser. Når det kombineres med imm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker RB Tesh for å gi musen polyklonale anti-RVFV antiserum og M. Griffin av UTMB flowcytometrisystemer Kjerne Facility for hjelp med flowcytometri. Dette arbeidet ble støttet av fem U54 AI057156 gjennom Western Regional Center of Excellence, NIH stipend R01 AI08764301, og midler fra Sealy Center for Vaccine Development ved UTMB.BK ble støttet av James W. McLaughlin Fellowship Fund på UTMB.OL ble støttet av en Maurice R. Hilleman tidlig stadium Career Investigator Award.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
