Мембрана-SPINE: Биохимический инструмента для выявления белок-белковых взаимодействий мембранных белков<em> В Vivo</em
Summary
Биохимический подход описан обнаружить прижизненно белок-белковых взаимодействий (PPI) мембранных белков. Метод сочетает в себе белок сшивание, аффинной очистки и масс-спектрометрии, и адаптируется к почти любой тип клеток или организма. При таком подходе даже определение переходных ИПП становится возможным.
Abstract
Мембранные белки имеют важное значение для жизнеспособности клеток и, следовательно, важные терапевтические мишени 1-3. Поскольку они функционируют в комплексах 4, методы выявления и характеризуют их взаимодействия необходимы 5. С этой целью мы разработали Стрептококковое-белка эксперимент взаимодействия мембраны, называется мембраной SPINE 6. Этот метод сочетает в естественных условиях сшивающего помощью обратимой сшивающего линкера формальдегида с аффинной очистки с Strep-меченого белка мембраны приманки. Во время процедуры сшитые добычи протеины совместно очищались с приманкой мембранного белка и затем разделяют путем кипячения. Таким образом, две основные задачи могут быть выполнены при анализе белок-белковых взаимодействий (ИЦП) мембранных белков с помощью мембранного позвоночника: во-первых, подтверждение предложенной партнером взаимодействия иммуноблоттингом, и, во-вторых, выявление новых партнеров взаимодействия с помощью масс-спектрометрического анализа . Более того, даже лой близость, переходные ИПП обнаруживаются по этой методике. Наконец, мембрана-SPINE адаптируется к почти любой тип клеток, что делает его применимым в качестве мощного инструмента скрининга для выявления ИЦП мембранных белков.
Introduction
Чтобы понять функцию белка важно знать своих партнеров взаимодействия. Несколько классические методы доступны для идентификации взаимодействия партнеров растворимых белков. Однако эти методы не легко передаваться с мембранными белками из-за их гидрофобной природы 4. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали Стрептококковое-белка взаимодействия эксперимент мембраны (мембраны позвоночника) 6. Он основан на методе позвоночника, который был пригоден только для растворимых белков 7.
Мембрана-ПОЗВОНОЧНИКА выгоды от двух преимуществ сшивающего агента формальдегида: во-первых, формальдегид легко проникают мембраны и, следовательно, создает точную снимок интерактома живой клетки 8. Во-вторых, формальдегид поперечные связи может быть отменено путем кипячения 9. Здесь, эти два преимущества используются для идентификации не только постоянные, но и переходных ИЦП мембранного защмодули 6.
Вкратце, Strep-тег слит с С-концом интегрального мембранного белка приманки. Клетки, экспрессирующие приманки мембранный белок инкубируют с формальдегидом, который сшивает охотятся белки с белком мембраны приманки (рис. 1). Модификации хищных белков не нужны. Далее, мембранную фракцию готов. Таким образом, мембранные белки, солюбилизируются лечения моющего средства и наживки белки совместно очищались с добычей белков с использованием аффинной очистки. Впоследствии сшивки восстанавливается посредством кипячения, и приманка и его со-элюированные белки добычи разделены SDS-PAGE. Наконец, добычи протеины могут быть идентифицированы путем иммуноблот-анализа или масс-спектрометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ Мембрана позвоночник биохимический подход, который дает возможность подтвердить и определить к этой точке неизвестных партнеров взаимодействия мембранных белков. Мембрана SPINE сочетает в естественных условиях сшивки формальдегидом с очистке Strep-меченого белка мембраны п?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 и SFB940 к SH
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat. Biotechnol. 25, (2007).
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
