झिल्ली रीढ़: झिल्ली प्रोटीन के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए एक जैव रासायनिक उपकरण<em> में Vivo</em
Summary
एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण झिल्ली प्रोटीन के vivo प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) की पहचान करने के लिए वर्णित है. विधि प्रोटीन पार से जोड़ने, आत्मीयता शुद्धि और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जोड़ती है, और लगभग किसी भी कोशिका प्रकार या जीव के लिए अनुकूल है. इस दृष्टिकोण के साथ, क्षणिक PPIs के भी पहचान संभव हो जाता है.
Abstract
झिल्ली प्रोटीन सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं और इसलिए महत्वपूर्ण चिकित्सकीय लक्ष्य 1-3 कर रहे हैं. वे परिसरों 4 में समारोह के बाद, उनकी बातचीत की पहचान और विशेषताएँ करने के तरीकों 5 जरूरी हैं. यह अंत करने के लिए, हम झिल्ली रीढ़ 6 बुलाया झिल्ली Strep, प्रोटीन बातचीत प्रयोग, विकसित की है. इस तकनीक को एक Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि के साथ प्रतिवर्ती पार linker formaldehyde का उपयोग कर पार से जोड़ने विवो में जोड़ती है. प्रक्रिया के दौरान, पार से जुड़े शिकार प्रोटीन झिल्ली चारा प्रोटीन के साथ सह शुद्ध किया और बाद में उबलते से अलग होती है. झिल्ली रीढ़ का उपयोग झिल्ली प्रोटीन के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (PPIs) का विश्लेषण इसलिए, जब दो प्रमुख कार्यों को क्रियान्वित किया जा सकता है: पहला, immunoblotting, और से एक प्रस्तावित बातचीत साथी की पुष्टि दूसरा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से नई बातचीत के भागीदारों की पहचान . इसके अलावा, यहां तक कि एलआत्मीयता ओउ, क्षणिक PPIs इस तकनीक द्वारा detectable हैं. अंत में, झिल्ली रीढ़ झिल्ली प्रोटीन की PPIs की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली प्रदर्शन उपकरण के रूप में इसे लागू कर रही है, लगभग किसी भी कोशिका प्रकार के लिए अनुकूल है.
Introduction
एक प्रोटीन के समारोह को समझने के लिए यह अपनी बातचीत भागीदारों पता करने के लिए आवश्यक है. कई शास्त्रीय तकनीक घुलनशील प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों की पहचान के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, इन तकनीकों उनके हाइड्रोफोबिक प्रकृति 4 की वजह से प्रोटीन झिल्ली आसानी से हस्तांतरणीय नहीं हैं. इस सीमा को पार करने के लिए, हम झिल्ली Strep, प्रोटीन बातचीत प्रयोग (झिल्ली रीढ़) 6 को विकसित किया है. यह घुलनशील प्रोटीन 7 के लिए ही उपयुक्त था जो रीढ़ पद्धति पर आधारित है.
पार से जोड़ने एजेंट formaldehyde के दो फायदे से झिल्ली रीढ़ लाभ: पहला, formaldehyde आसानी झिल्ली घुसना और इसलिए एक जीवित कोशिका 8 interactome का एक सटीक स्नैपशॉट उत्पन्न कर सकते हैं. दूसरा, formaldehyde पार से लिंक 9 उबलते द्वारा उलट हो सकता है. इधर, इन दो फायदे झिल्ली prote की स्थायी लेकिन यह भी क्षणिक PPIs न केवल पहचान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंआईएनएस 6.
संक्षेप में, एक Strep टैग अभिन्न झिल्ली चारा प्रोटीन की सी टर्मिनस से जुड़े हुए है. झिल्ली चारा प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं पार से लिंक झिल्ली चारा प्रोटीन के लिए प्रोटीन का शिकार जो formaldehyde (चित्रा 1) के साथ incubated हैं. शिकार प्रोटीन के संशोधन की जरूरत नहीं कर रहे हैं. अगला, झिल्ली अंश तैयार है. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर अपने शिकार प्रोटीन के साथ सह शुद्ध कर रहे हैं डिटर्जेंट उपचार और चारा द्वारा solubilized रहे हैं. बाद में, पार से लिंक उबलते से उलट है, और चारा और उसके सह eluted शिकार प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं. अंत में, शिकार प्रोटीन immunoblot विश्लेषण या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
झिल्ली रीढ़ विश्लेषण की पुष्टि करने और झिल्ली प्रोटीन के इस बिंदु अज्ञात बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए एक सक्षम बनाता है एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण है. झिल्ली रीढ़ एक Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एसएच लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 और SFB940 का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
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