Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen
Summary
Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.
Abstract
Bei der Differenzierung der Hokulären Keimzellen ändert sich die Struktur des Kernchromatins dynamisch. Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die dreidimensionale Chromatinanordnung von Hodenkeimzellen bei Mäusen erhalten werden soll; Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Bei dieser Methode werden Hodentubuli direkt mit einem Permeabilisierungsschritt behandelt, der zytoplasmatisches Material entfernt, gefolgt von einem Fixierungsschritt, der Kernmaterialien fixiert. Tubules werden dann dissoziiert, die Zellsuspension ist zytospun, und Zellen haften an Dias. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und die Kombination dieser Nachweismethoden anwendbar. Als Beispiel für eine mögliche Anwendung der 3D-Diamethode wird gezeigt, dass ein Cot-1-RNA-FISH entstehende RNAs erkennt. Die 3D-Diamethode wird die detaillierte Untersuchung räumlicher Zusammenhänge zwischen Chromatinstruktur, DNA und RNA während der Differenzierung von Hodenkeimzellen erleichtern.
Introduction
In Hoden unterscheiden sich Keimzellen von diploider Spermatogonie durch Meiose zu reifem, haploiden Spermatozoen. Dabei wird die Kernchromatinstruktur von Keimzellen kontinuierlich und dynamisch umgestaltet. Oberflächenbreiten werden häufig für die zytologische Untersuchung einzelner spermatogener Zellen verwendet. Eine vorherrschende Methode der Oberflächenausbreitung verwendet hypotonische Behandlung, durch die einzelne spermatogene Zellen verteilt und abgeflacht werden1. Diese Bedingungen sind optimal für die detaillierte Analyse meiotischer Chromosomen. Chromosomale Merkmale wie synaptische Status und Rekombinationsschwerpunkte sind mit dieser Methode leicht zu beobachten. Die hypotonische Behandlung stört jedoch die subnukleare Chromatinarchitektur, so dass diese Technik nicht für die strukturelle Analyse von Kernen geeignet ist. Daher wurde eine verbesserte Methode entwickelt, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet (Abbildung 1). Die 3D-Diamethode hat den Nachweis der entstehenden RNA-Lokalisierung in Kernen ermöglicht, da sie ursprünglich optimiert wurde, um Genexpression und Chromatinzustände während der Differenzierung von Hokulären Keimzellen durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)2,3zu untersuchen. Diese 3D-Methode ist auch auf die Kombination von Immunfluoreszenz, DNA und RNA FISH anwendbar. Zusätzlich hat diese Methode bei der Entdeckung von postmetiotischem Sexchromatin (PMSC) unterstützt, einem stillen Fach der Geschlechtschromosomen, die in postmetiotischen Spermaatiden gefunden werden2.
Die 3D-Folienmethode wurde ursprünglich durch die Kombination von zwei wesentlichen Schritten der Gleitvorbereitung optimiert, die häufig für die Kernfärbung verwendet werden: der Befestigungsschritt zur Fixierung von Kernmaterialien und der Permeabilisierungsschritt zur Entfernung von zytoplasmatischen Materialien, um die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und FISH-Sonden zu verbessern. Wie bereits in einer anderen Publikation3beschrieben, wurde festgestellt, dass der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt vorausgehen muss, um optimale Ergebnisse mit niedrigem zytoplasmatischen Hintergrund zu erzielen. Bei dieser 3D-Diamethode werden der Permeabilisierungsschritt und der nachfolgende Fixierungsschritt direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt und es folgt die mechanische Dissoziation von Keimzellen mit Zangen vor dem Zytospinnen auf Dias. Eine alternative Methode für RNA FISH von spermatogenen Zellen wurde in einem anderen Labor entwickelt4. Bei dieser Methode muss der Permeabilisierungsschritt im Einklang mit der 3D-Methode dem Fixierungsschritt vorausgehen, um optimale Ergebnisse von RNA FISH zu erhalten.
Das folgende Protokoll beschreibt die 3D-Diamethode und liefert ein Beispiel für eine mögliche Anwendung, Cot-1 RNA FISH zum Nachweis von kernimimten RNAs. Cot-1 DNA besteht aus sich wiederholenden Elementen im Genom. Hierbei wird eine Cot-1-DNA-Sonde zu einem Intron und UTR der entstehenden Transkripte hybridisiert, wodurch die transkriptionsaktiven Regionen im Kern5,6erkannt werden. 3D-Dias sind vielseitig und können auf eine Kombination von Immunfluoreszenz-, DNA- und RNA-FISH-Techniken angewendet werden, um eine detaillierte Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen Chromatinarchitektur zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der 3D-Folienvorbereitung geht der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt voraus. Diese Schritte werden direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt, wodurch die dreidimensionale Chromatinstruktur erhalten bleibt. Eine alternative Möglichkeit zur Erhaltung der Chromatinstruktur für RNA/DNA FISH besteht darin, den Permeabilisationsschritt und den Fixierungsschritt gleichzeitig durchzuführen. Diese alternative Technik wurde in Beuteltierkeimzellen und in Mauspräimplantationsembryonen7,8durchgefüh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich danke Jeannie T. Lee für die Betreuung dieses Projekts, als ich im Lee-Labor war, und Tyler Broering für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Basil O’Connor Starter Scholar Award der March of Dimes Foundation und den NIH Grant GM098605 unterstützt.
Materials
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
| Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Forceps | VWR | 300-050 |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
| Cytospin 3 | Shandon | |
| Coplin jar | Fisher | 08-815 |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
