Skyv forberedelsesmetode for å bevare tredimensjonal kromatinarkitektur av testikkel bakterieceller

Summary

Materialet her beskriver en metode utviklet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Dette kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. Denne metoden forbedrer følsomheten for påvisning av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH).

Abstract

Under testikkel bakteriecelledifferensiering endres strukturen av kjernefysisk kromatin dynamisk. Følgende beskriver en metode designet for å bevare det tredimensjonale kromatinarrangementet av testikkel bakterieceller som finnes hos mus; Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. I denne metoden behandles testikulære tubuli direkte med et permeabiliseringstrinn som fjerner cytoplasmisk materiale, etterfulgt av et fikseringstrinn som løser kjernefysiske materialer. Tubules blir deretter dissosiert, cellefjæringen er cytospun, og cellene holder seg til lysbilder. Denne metoden forbedrer følsomheten mot deteksjon av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) og kombinasjonen av disse deteksjonsmetodene. Som et eksempel på en mulig anvendelse av 3D-lysbildemetoden, vises en Cot-1 RNA FISH for å oppdage nascent RNAer. 3D-glidemetoden vil lette den detaljerte undersøkelsen av romlige sammenhenger mellom kromatinstruktur, DNA og RNA under testikkel bakteriecelledifferensiering.

Introduction

I testikler skiller bakterieceller seg fra diploid spermatogonia gjennom meiosis til moden, haploid spermatozoa. Under denne prosessen blir den kjernefysiske kromatinstrukturen til bakterieceller kontinuerlig og dynamisk ombygd. Overflatespredninger brukes ofte til cytologisk undersøkelse av individuelle spermatogene celler. En rådende metode for overflatespredninger bruker hypotonisk behandling der individuelle spermatogene celler spres og flates¹. Disse forholdene er optimale for detaljert analyse av meiotiske kromosomer. Kromosomale egenskaper som synaptisk status og rekombinasjonsfokus observeres lett ved hjelp av denne metoden. Den hypotoniske behandlingen forstyrrer imidlertid subnukleær kromatinarkitektur, og denne teknikken er derfor ikke egnet for strukturell analyse av kjerner. Følgelig er en forbedret metode designet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden (Figur 1). 3D-lysbildemetoden har gjort det mulig å oppdage nascent RNA-lokalisering i kjerner fordi den i utgangspunktet var optimalisert for å undersøke genuttrykk og kromatintilstander under testikkel bakteriecelledifferensiering av RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH)^2,3. Denne 3D-metoden gjelder også for kombinasjonen av immunfluorescens, DNA og RNA FISH. I tillegg har denne metoden hjulpet til med oppdagelsen av postmetiotisk kjønnskromatin (PMSC), et stille rom i kjønnskromosomene som finnes i postmetiotiske spermatider².

3D-glidemetoden ble opprinnelig optimalisert gjennom kombinasjonen av to viktige trinn i lysbildeforberedelse som vanligvis brukes til kjernefysisk farging: fikseringstrinnet designet for å fikse kjernefysiske materialer og permeabiliseringstrinnet som er ment å fjerne cytoplasmatiske materialer for å forbedre tilgjengeligheten av fargingsreagenser, for eksempel antistoffer og FISH-sonder. Som tidligere beskrevet i en annen publikasjon³, har det blitt fastslått at permeabiliseringstrinnet må komme før fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater med lav cytoplasmisk bakgrunn. I denne 3D-lysbildemetoden utføres permeabiliseringstrinnet og det påfølgende fikseringstrinnet direkte på seminiferøse tubuli og etterfølges av mekanisk dissosiasjon av bakterieceller med tang før cytospinning på lysbilder. En alternativ metode for RNA FISH av spermatogene celler ble utviklet i et annet laboratorium⁴. I denne metoden, i samsvar med 3D-metoden, må permeabiliseringstrinnet gå foran fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater av RNA FISH.

Følgende protokoll beskriver 3D-glidemetoden og gir et eksempel på et mulig program, Cot-1 RNA FISH for påvisning av kjernefysiske nascent RNAer. Cot-1 DNA består av repeterende elementer i genomet. Her er en Cot-1 DNA-sonde hybridisert til en intron og UTR av de ekkel transkripsjonene, og oppdager dermed de transkripsjonsaktive områdene i kjernen^5,6. 3D-lysbilder er allsidige og kan brukes på en kombinasjon av immunfluorescens, DNA- og RNA FISH-teknikker for å oppnå detaljert undersøkelse av romlige sammenhenger mellom kromatinarkitektur.

Protocol

1.3D Klargjøring av lysbilde Forbered følgende reagenser: CSK buffer: 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Juster pH til 6,8 med 1 M NaOH. Oppbevar CSK-bufferen ved 4 °C. CSK-buffer med 0,5 % Triton X-100: Tilsett 200 μl Triton X-100 til 40 ml CSK-buffer. Bland oppløsningen ved hjelp av magnetisk omrører til Triton X-100 er helt oppløst. Oppbevar CSK-bufferen med 0,5 % Triton X-100 ved 4 °C. 4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Løs opp 4 g PF…

Representative Results

Et representativt resultat av et 3D-lysbilde vises i figur 2. I dette eksperimentet ble Cot-1 RNA FISH utført for å oppdage nascent transkripsjon sammen med immunostaining ved hjelp av anti CBX1 og γH2AX antistoffer. For å kombinere RNA FISH og immunstaining ble immunstaining utført først, etterfulgt av RNA FISH som beskrevet i3. CBX1 er et heterokromatinprotein som lokaliserer til pericentromerisk heterokromatin og stille kjønnskromosomer i meiosis kalt en XY-kropp (eller sexkropp). γ…

Discussion

I 3D-lysbildeforberedelse går permeabiliseringstrinnet foran fikseringstrinnet. Disse trinnene utføres direkte på seminiferøse tubuli, og bevarer dermed den tredimensjonale kromatinstrukturen. Et alternativt alternativ til å bevare kromatinstruktur for RNA/DNA FISH er å utføre permeabiliseringstrinnet og fikseringstrinnet samtidig. Denne alternative teknikken har blitt utført i buktige bakterieceller og i musepreimplantasjonsembryoer^7,8. Men hvis fikseringstrinnet går foran permeabiliseringstrinnet, k…

Materials

Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit	Agilent	300380
Herring sperm DNA Solution	Invitrogen	15634-017
Ethanol, 200 proof (absolute)	Pharmco-AAPER	111000200
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionized	American Bioanalytical	AB00600-00500
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma-Aldrich	C8532
Bovine serum albumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	76240
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Forceps	VWR	300-050
Microcentrifuge tubes	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
4-well dish	Fisher	12-566-301
Cover glass	Fisher	12-544-G
Air incubator	Revolutionary Science	RS-IF-203