Método de preparación de diapositivas para preservar la arquitectura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares
Summary
El material aquí describe un método desarrollado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares. Esto se ha denominado el método de diapositiva tridimensional (3D). Este método mejora la sensibilidad para la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH).
Abstract
Durante la diferenciación testicular de la célula de germen, la estructura de la cromatina nuclear cambia dinámicamente. A continuación se describe un método diseñado para preservar la disposición tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares que se encuentran en ratones; este método se ha denominado como el método de diapositiva tridimensional (3D). En este método, los túbulos testiculares se tratan directamente con un paso de permeabilización que elimina el material citoplasmático, seguido de un paso de fijación que fija los materiales nucleares. Los túbulos se disocian, la suspensión celular es citospun, y las células se adhieren a los portaobjetos. Este método mejora la sensibilidad hacia la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) y la combinación de estos métodos de detección. Como ejemplo de una posible aplicación del método de deslizamiento 3D, se muestra que un COT-1 RNA FISH detecta ARN nacientes. El método de deslizamiento 3D facilitará el examen detallado de las relaciones espaciales entre la estructura de la cromatina, el ADN y el ARN durante la diferenciación testicular de las células germinativas.
Introduction
En los testículos, las células germinales se diferencian de la espermatogonia diploide a través de la meiosis en espermatozoides maduros y haploides. Durante este proceso, la estructura de la cromatina nuclear de las células germinales se remodela de forma continua y dinámica. Las separaciones superficiales son de uso general para la examinación citológica de células espermatogénicas individuales. Un método predominante de diseminaciones superficiales emplea el tratamiento hipotónico por el cual las células espermatogénicas individuales se propagan y aplanan1. Estas condiciones son óptimas para el análisis detallado de cromosomas meióticos. Las características cromosómicas tales como focos sinápticos de la situación y de la recombinación se observan fácilmente usando este método. Sin embargo, el tratamiento hipotónico interrumpe la arquitectura de la cromatina subnuclear, por lo que esta técnica no es adecuada para el análisis estructural de núcleos. Por lo tanto, un método mejorado se ha diseñado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de células de germen testiculares. Este método se ha denominado como el método de diapositiva tridimensional (3D) (Figura 1). El método de deslizamiento 3D ha permitido la detección de localización de ARN naciente en núcleos, ya que inicialmente se optimizó para examinar la expresión génica y los estados de cromatina durante la diferenciación de células germinales testiculares por hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH)2,3. Este método 3D también es aplicable a la combinación de inmunofluorescencia, ADN y ARN FISH. Además, este método ha ayudado en el descubrimiento de la cromatina sexual postmeiótica (EMPS), un compartimento silencioso de los cromosomas sexuales que se encuentran en las espermicidas postmeióticas2.
El método de deslizamiento 3D se optimizó originalmente a través de la combinación de dos pasos esenciales de preparación de diapositivas comúnmente utilizados para la tinción nuclear: el paso de fijación diseñado para fijar materiales nucleares y el paso de permeabilización destinado a eliminar materiales citoplasmáticos para mejorar la accesibilidad de los reactivos de tinción, como anticuerpos y sondas FISH. Como se describió anteriormente en otra publicación3,se ha determinado que la etapa de permeabilización debe preceder a la etapa de fijación con el fin de obtener resultados óptimos con bajo fondo citoplasmático. En este método de deslizamiento 3D, el paso de permeabilización y el paso de fijación posterior se realizan directamente en túbulos seminíferos y son seguidos por la disociación mecánica de células germinales con fórceps antes de citoespinning en diapositivas. Un método alternativo para los PECES DE ARN de las células espermatogénicas se desarrolló en otro laboratorio4. En este método, consistente con el método 3D, el paso de permeabilización debe preceder al paso de fijación para obtener resultados óptimos de RNA FISH.
El siguiente protocolo describe el método de deslizamiento 3D y proporciona un ejemplo de una posible aplicación, Cot-1 RNA FISH para la detección de ARN nucleares nacientes. El ADN de cot-1 consiste en elementos repetitivos en el genoma. Aquí, una sonda de ADN Cot-1 se hibrida con un intrón y UTR de las transcripciones nacientes, detectando así las regiones transcripcionalmente activas en el núcleo5,6. Las diapositivas 3D son versátiles y se pueden aplicar a una combinación de técnicas de inmunofluorescencia, ADN y ARN FISH para obtener un examen detallado de las relaciones espaciales entre la arquitectura de la cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la preparación de diapositivas 3D, el paso de permeabilización precede al paso de fijación. Estos pasos se realizan directamente sobre túbulos seminíferos, preservando así la estructura tridimensional de la cromatina. Una opción alternativa para preservar la estructura de la cromatina para el ARN/ADN FISH es realizar la etapa de permeabilización y la etapa de fijación simultáneamente. Esta técnica alternativa se ha realizado en células germinales marsupiales y en embriones preimplantacional de ratón7…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradezco a Jeannie T. Lee por la supervisión de este proyecto cuando estaba en el laboratorio Lee y a Tyler Broering por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Basil O’Connor Starter Scholar Award de march of dimes Foundation y la nih grant GM098605.
Materials
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
| Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Forceps | VWR | 300-050 |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
| Cytospin 3 | Shandon | |
| Coplin jar | Fisher | 08-815 |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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