Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus
Summary
Tre assays, herunder cytopatisk effekt (CPE)-baserede assay, dosis-respons analyse og Time-of-Addition (ToA) assay er blevet udviklet, optimeret, valideret og udnyttet til at identificere nye antivirale mod bluetongue-virus (BTV), samt at bestemme mulig mekanisme-of-aktion (Landbrugsministeriet) for nyligt identificerede antivirale lægemidler.
Abstract
At identificere potentielle antivirale mod BTV, har vi udviklet, optimeret og valideret tre analyser, der præsenteres her. CPE-assay var det første assay udviklet til at vurdere, om en forbindelse viste nogen antiviral virkning og har været anvendt til at screene store stofbibliotek. I mellemtiden kunne cytotoksicitet af antivirale lægemidler også evalueret ved brug af CPE-baserede assay. Dosis-respons-assay blev udviklet til at bestemme området for effekten for den valgte antivirale, dvs 50% hæmmende koncentration (IC50) eller effektiv koncentration (EC50), samt sit sortiment af cytotoksicitet (CC 50). Toa assay blev anvendt til den indledende MoA undersøgelse for at bestemme den underliggende mekanisme af de nye antivirale løbet BTV virale livscyklus eller den mulige indvirkning på host cellulære maskineri. Disse analyser er afgørende for vurderingen af antiviral effekt i cellekultur-system, og har været brugt til vores seneste undersøgelser førerning til identifikation af en række nye antivirale mod BTV.
Introduction
BTV er en prototype dobbeltstrenget RNA virus i slægten orbivirus, familien Reoviridae. BTV er et af de vigtigste sygdomme i husdyr, herunder får, geder, kvæg og andre husdyr, med 3 milliarder dollars / år tab på verdensplan 1,2. Den eksotiske BTV serotype er en vigtig animalske patogener anført i "USDA High Konsekvens Livestock patogener." For nylig, den genopståede af BTV har forårsaget et stort sygdomsudbrud hos kvæg og får i flere lande i Nordeuropa 3,4. Som et resultat af dens økonomiske betydning og som en model system, har BTV været genstand for omfattende molekylære, genetiske og strukturelle studier, og flere vacciner er blevet udviklet. Men på grund af mangel på ordentlig assays for antiviral lægemiddelforskning, er der ingen antivirale tilgængelige mod BTV.
I en nylig high throughput screening (HTS) kampagne ved hjælp BTV som model system, er vi developed, optimeret og valideret en CPE-baserede assay til at identificere potentielle bredspektrede antivirale mod arbovira 5. CPE-assay er en velkendt assay, der har været anvendt i antiviral lægemiddeludvikling mod en række vira, som inducerede hurtig og observerbar CPE / apoptose 5-7. I vores system, post BTV infektion, CPE er tydelig i hvirveldyr celler, herunder HeLa, BSR, og HEK 293T 8. BTV-induceret CPE kan overvåges og kvantificeres ved hjælp af forskellige celle levedygtighed påvisningsmetoder, herunder CellTiter Glo cellelevedygtighed reagens kit (CTG kit) 9.. Dette sæt bestemmer antallet af levedygtige celler i kultur baseret på kvantificering af cellulære ATP præsenteret, som signalerer tilstedeværelsen af metabolisk aktive levende celler. Under optimerede betingelser, CPE-baserede assay præsenteres her viste sin gennemførlighed med "mix og måle" et skridt protokol og fleksibilitet med stabile selvlysende signaler. I mellemtiden, giftige forbindelser redusiering celleviabilitet vil blive udelukket i denne CPE-baserede assay. CPE-assay viste sin robusthed og pålidelighed for antiviral lægemiddeludvikling mod BTV og er blevet anvendt til at screene NIH Molecular Biblioteker Small Molecule Repository (MLSMR), hvilket fører til identifikation af seks nye klynge af potentiel antiviral bly forbindelse (r ) 5..
Når en potentiel antiviral forbindelse er blevet identificeret ved hjælp af CPE-assay, vil det være nødvendigt at blive udsat for den ti-koncentrationen af dosis-respons-assay for at bestemme området af antiviral effekt og cytotoksicitet 2. Den antivirale effektivitet, repræsenteret som 50% hæmmende koncentration (IC50) eller 50% effektive koncentration (EC50), er koncentrationen af et lægemiddel, som inhiberer virus-induceret CPE halvvejs mellem baseline og maksimum. Cytotoksiciteten af antivirale lægemidler, dvs koncentration 50% cytotoksicitet (CC 50), er koncentrationenaf et lægemiddel inducerer 50% af cytotoksicitet mellem baseline og maksimum. Den selektive indeks (SI), betegnet 50% SI (SI 50) beregnes ud fra CC 50 / IC 50 som bestemmer specificiteten af det antivirale mod virus-induceret CPE. IC 50 (eller EF-50), CC 50 og SI 50 værdier er kritiske foranstaltninger for at afgøre, om en antiviral forbindelse er potent og selektiv for yderligere udvikling af lægemidler.
Når et antiviralt viste ingen åbenbar toksicitet in vitro, men forhindret virus induceret CPE og den produktive virale livscyklus, er det vigtigt at karakterisere sin MoA 2. Vi indledte en sådan karakterisering ved at udføre ToA assay til at bestemme den mulige skridt (r) af viral livscyklus, som er påvirket af det antivirale. Generelt blev antiviral forbindelse tilsat til celler på forskellige tidspunkter præ-eller post-virusinfektion. Hvis antivirale blev føjet til de inficerede celler post til sit mål stoe i løbet af infektion, vil det resultere i en lavere aktivitet, når sammenlignet med den, som blev tilsat forud for trin. Således ToA undersøgelse er afgørende for at bestemme den antivirale effekt af et stof, og dets potentielle mål, enten på den virale livscyklus eller værten maskiner er involveret i den virale livscyklus.
For alle tre analyser, blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af CTG-kit efter fabrikantens anvisninger 5.. Denne afsløring Systemet sender tilstrækkelige luminescens-signaler, der kunne analyseres ved hjælp af forskellige in-house software. Hvert assay blev valideret og udført mindst tre gange med otte reproduktioner. For alle de indsamlede data blev tre parametre, herunder middelværdi (AVE), standardafvigelse (STDEV), og co-effektive variation (CV) analyseres for at bestemme robustheden af analysen. Når robusthed analysen er fastlagt, vil data blive analyseret og plottet ved hjælp af forskellige biostatics og grafiskc værktøjer 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
For den indledende identifikation af antivirale hits, en af de vigtigste trin i antiviral lægemiddelforskning og-udvikling er at udvikle robuste analyser, som omfatter valg af en kvantificerbar markør, udvikle en simpel protokol, opnå tilstrækkelig signaler og mindre end 10% CV. De fleste biokemiske eller cellebaserede skærme er designet til at give en kemisk udgangspunkt baseret på den mest robuste, enkle og billige assay, på grund af den krævede reproducerbarhed i udvælgelsesprocessen, og det potentielt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af tilskud 1R03MH08127-01 og 7R03MH08127-02 fra NIH til Q. Li, og af virkningen midler fra Institut for Medicin på UAB til Q. Li. Støtte fra Molette fonden og Auburn University er værdsat. Vi takker også de tekniske assistances fra Ms Pulin Che og Mr. Volodymyr Musiienko i løbet af arbejdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
