Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus
Summary
Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.
Abstract
Om potentiële antivirale middelen tegen BTV identificeren, hebben we ontwikkeld, geoptimaliseerd en gevalideerd drie assays hier gepresenteerd. De CPE-assay was de eerste test ontwikkeld om te evalueren of een verbinding vertoonde antivirale werkzaamheid en werden gebruikt voor het screenen grote samengestelde bibliotheek. Ondertussen cytotoxiciteit van antivirale kan worden geëvalueerd met de CPE gebaseerde test. De dosis-respons test werd ontworpen om het bereik van werkzaamheid van de gekozen antivirale bepalen, namelijk 50% remmende concentratie (IC50) of effectieve concentratie (EC50), alsook het gamma cytotoxiciteit (CC50). De ToA test werd gebruikt voor de eerste MoA onderzoek naar de onderliggende mechanismen van de nieuwe antivirale middelen tijdens BTV virale levenscyclus of het mogelijke effect op de gastheer cellulaire machinerie bepalen. Deze testen zijn van vitaal belang voor de evaluatie van antivirale effectiviteit in celcultuur systeem en zijn gebruikt voor onze recente onderzoeken leidening tot de identificatie van een aantal nieuwe antivirale middelen tegen BTV.
Introduction
BTV is een prototype double-stranded RNA-virus in het geslacht Orbivirus, familie Reoviridae. BTV is een van de belangrijkste ziekten van vee, zoals schapen, geiten, runderen en andere huisdieren, met $ 3000000000 / jaar verlies wereldwijd 1,2. De exotische BTV serotype is een belangrijke verwekker van dierziekten in de beursgenoteerde "USDA High Consequence Vee Ziekteverwekkers." Onlangs heeft de re-opkomst van BTV is een grote uitbraak van de ziekte bij runderen en schapen veroorzaakt in verschillende landen in Noord-Europa 3,4. Als gevolg van de economische waarde en als modelsysteem is BTV het onderwerp van uitgebreid moleculaire, genetische en structurele studies, en verscheidene vaccins ontwikkeld. Echter, vanwege het gebrek aan goede assays voor antivirale medicijnontwikkeling, er geen antivirale middelen beschikbaar tegen BTV.
In een recente high throughput screening (HTS) campagne met behulp van BTV als modelsysteem, we developed, geoptimaliseerd en gevalideerd een-CPE-gebaseerde test om potentiële breed-spectrum antivirale middelen tegen arboviruses 5 identificeren. CPE-gebaseerde test is een goed erkende test die is gebruikt in antivirale medicijnontwikkeling tegen een aantal virussen die snelle en waarneembare CPE / apoptose geïnduceerd 5-7. In ons systeem, post BTV infectie, CPE is duidelijk in cellen van gewervelde dieren, met inbegrip van HeLa, BSR, en HEK 293T 8. BTV-geïnduceerde CPE zou kunnen worden gecontroleerd en gekwantificeerd met behulp van diverse cel levensvatbaarheid detectiemethoden, waaronder de CellTiter Glo celuitvoerbaarheid reagentiakit (CTG kit) 9. Deze set bepaalt het aantal levensvatbare cellen in kweek op basis van kwantificering van cellulaire ATP gepresenteerd, waarbij de aanwezigheid van metabolisch actieve levende cellen signalen. Onder optimale omstandigheden, de CPE-gebaseerde test hier gepresenteerde toonde de haalbaarheid met de "mix en meet" een stap protocol, en flexibiliteit met stabiele lichtgevende signalen. Ondertussen, toxische verbindingen reducing cellevensvatbaarheid zal deze CPE-assay worden uitgesloten. De CPE assay toonde de robuustheid en betrouwbaarheid antivirale medicijnontwikkeling tegen BTV, en is gebruikt voor het screenen NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), wat leidt tot de identificatie van zes nieuwe cluster potentiële antivirale loodverbinding (s ) 5.
Wanneer een potentiële antivirale verbinding is geïdentificeerd met de CPE-gebaseerde test, zal het moeten worden onderworpen aan de tien-concentratie dosis-respons bepaling om het bereik van antivirale werkzaamheid en cytotoxiciteit 2 bepalen. De antivirale werkzaamheid, weergegeven als de 50% remmende concentratie (IC50) en de 50% effectieve concentratie (EC50), is de concentratie van een drug die virus-geïnduceerde CPE halverwege tussen de basislijn en de maximale remt. De cytotoxiciteit van de antivirale middelen, namelijk de 50% cytotoxiciteit concentratie (CC50), de concentratievan een geneesmiddel induceren 50% cytotoxiciteit tussen de basislijn en maximum. De selectieve index (SI), aangeduid als 50% SI (SI 50) wordt berekend op basis van CC 50 / IC 50 die de specificiteit van het antivirale tegen virus-geïnduceerde CPE bepaalt. De IC50 (of EC 50), CC50 en SI 50 waarden essentieel maatregelen te bepalen of een antivirale verbinding krachtige en selectieve verdere ontwikkeling van geneesmiddelen.
Wanneer een antiviraal vertoonden geen openlijke toxiciteit in vitro, maar voorkomen virus-geïnduceerde CPE en productieve virale levenscyclus is belangrijk de MoA 2 karakteriseren. We begonnen deze karakterisering door middel van ToA test om eventuele stap (pen) van virale levenscyclus die wordt beïnvloed door de antivirale bepalen. Algemeen antivirale verbinding werden toegevoegd aan cellen op verschillende tijdstippen vóór of na virusinfectie. Indien de antivirale toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen posten zijn doel sTEP tijdens infectie, zou dit resulteren in lagere activiteit vergeleken met die van vóór de stap toegevoegd. Aldus ToA studie is kritiek voor het bepalen van de antivirale effectiviteit van een verbinding, en het potentieel doel, hetzij op virale levenscyclus of de ontvangende machine betrokken bij de virale levenscyclus.
Voor alle drie testen, werd levensvatbaarheid van de cellen bepaald met behulp van de CTG-kit volgende fabrikant instructie 5. Dit detektiestelsel voert adequate fluorescentie signalen die kunnen worden geanalyseerd met behulp van diverse in-house software. Elke test werd gevalideerd en uitgevoerd ten minste in drievoud met acht replica. Voor alle verkregen gegevens werden drie parameters, waaronder gemiddelde waarde (AVE), standaarddeviatie (STDEV) en coëfficiënt variatie (CV) geanalyseerd om de robuustheid van de test te bepalen. Zodra de robuustheid van de test is vastgesteld, worden de gegevens verder worden geanalyseerd en uitgezet met verschillende Biostatistiek en grac onderdelen 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de initiële identificatie van antivirale hits, een van de belangrijkste stappen voor antivirale ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen is om robuuste assays te ontwikkelen, waaronder het selecteren van een kwantificeerbare marker, het ontwikkelen van een eenvoudig protocol, om voldoende signalen en minder dan 10% CV. De meeste biochemische of celgebaseerde schermen zijn ontworpen om een chemische startpunt gebaseerd op de meest robuuste, eenvoudige en goedkope test verschaffen vanwege de vereiste repr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door subsidie 1R03MH08127-01 en 7R03MH08127-02 van NIH naar Q. Li, en door de impact fondsen van afdeling Geneeskunde aan UAB Q. Li. De steun van de Molette Fonds en Auburn University wordt gewaardeerd. We danken ook de technische handreikingen van Ms Pulin Che en de heer Volodymyr Musiienko in de loop van het werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
