Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus
Summary
Tre analyser, inkludert den cytopatiske effekt (CPE)-baserte assay, dose-respons-analyse og Time-of-Addition (TOA) assay er blitt utviklet, optimalisert, validert og anvendt for å identifisere nye antivirale midler mot blutetonguevirus (BTV), samt som å bestemme mulige Mechanism-of-Handling (MoA) for nylig identifiserte antivirals.
Abstract
Å identifisere potensielle antivirale midler mot BTV, har vi utviklet, optimalisert og validert tre analysene som presenteres her. Den CPE-baserte analysen var det første assay utviklet for å evaluere hvorvidt en forbindelse viste noen antiviral effekt, og har blitt brukt for å screene store sammensatte bibliotek. Samtidig cytotoksisitet av antivirale midler kan også bli evaluert ved hjelp av CPE-basert assay. Dose-respons-analyse ble utviklet for å bestemme omfanget av effekt for den valgte antivirale, dvs. 50% hemmende konsentrasjon (IC 50), eller den effektive konsentrasjon (EC 50), så vel som dets spekter av cytotoksisitet (CC 50). Toa analysen ble ansatt for den innledende MoA studie for å fastslå den underliggende mekanismen for de nye antivirale midler under BTV viral livssyklus eller den mulige effekt på verten cellulære maskiner. Disse analyser er viktig for vurdering av antiviral effekt i cellekultursystem, og har vært brukt i våre nylige undersøkelser førering til identifisering av en rekke nye antivirale midler mot BTV.
Introduction
BTV er en prototype dobbel-strandet RNA-virus i slekten Orbivirus, familie Reoviridae. BTV er en av de viktigste sykdommer i husdyr, inkludert sau, geit, storfe og andre husdyr, med $ 3000000000 / år tap på verdensbasis 1,2. Den eksotiske BTV serotype er et viktig dyr patogen oppført i "USDA høy konsekvens oppdrett patogener." Nylig re-fremvoksende av BTV har forårsaket et stort utbrudd av sykdom hos storfe og sau i flere land over hele Nord-Europa 3,4. Som et resultat av dens økonomiske betydning og som et modellsystem, og BTV vært gjenstand for omfattende molekylære genetiske og strukturelle studier, og flere vaksiner har blitt utviklet. Imidlertid, på grunn av mangel på riktig analyser for antiviral medisiner, er det ingen tilgjengelige antivirale midler mot BTV.
I en nylig høy gjennomstrømming screening (HTS) kampanjen ved hjelp av BTV som modellsystem, vi developed, optimalisert og validert en CPE-basert analyse for å identifisere potensielle bredspekt antivirals mot arboviruses fem. CPE-baserte analysen er en velkjent metode som har vært brukt i antiviral medisiner mot en rekke virus som induseres hurtig og observerbar CPE / apoptose 5-7. I vårt system, post BTV infeksjon, er CPE tydelig i virveldyr celler, inkludert HeLa, BSR, og HEK 293T åtte. BTV-indusert CPE kunne overvåkes og kvantifisert ved hjelp av ulike celle levedyktighet deteksjonsmetoder, inkludert CellTiter Glo celleviabilitet agenssettet (CTG kit) 9. Dette settet bestemmer antallet levedyktige celler i kulturen basert på kvantifisering av cellulære ATP presentert, som signaliserer tilstedeværelsen av metabolsk aktive levende celler. Under optimale forhold, CPE-baserte analysen som presenteres her viste sin mulighetsstudie med "mikse og måle" ett skritt protokollen, og fleksibilitet med stabile selvlysende signaler. I mellomtiden, giftige forbindelser reduprosjektfinansiering celleviabilitet vil bli ekskludert i denne CPE-baserte analysen. CPE-baserte analysen viste sin robusthet og pålitelighet for antiviral medisiner mot BTV, og har blitt brukt til å skjerme NIH Molekylær biblioteker Small Molecule Repository (MLSMR), noe som fører til identifisering av seks roman klynge av potensiell antiviral lead compound (s ) 5.
Når en potensiell antivirale forbindelsen har blitt identifisert ved hjelp av CPE-baserte assay, må den bli utsatt for ti-konsentrasjonen dose-respons-analyse for å bestemme området for antiviral effekt og cytotoksisitet 2.. Den antivirale effekt, representert som den 50% hemmende konsentrasjon (IC 50), eller den 50% effektive konsentrasjon (EC 50), er konsentrasjonen av et stoff som inhiberer virus-indusert CPE midt mellom grunnlinjen og maksimum. Cytotoksisiteten av de antivirale midler, dvs. 50% cytotoksisitet konsentrasjon (CC 50), er konsentrasjonenav et medikament som induserer 50% av cytotoksisitet mellom grunnlinjen og maksimum. Den selektiv indeks (SI), betegnet som 50% SI (SI 50) beregnes ut fra CC 50 / IC 50 som bestemmer spesifisiteten av antiviral mot virus-indusert CPE. IC 50 (eller EF 50), CC 50 og SI 50 verdier er kritiske tiltak for å avgjøre om en antiviral compound er potent og selektiv for videreutvikling av narkotika.
Når et antiviralt viste ingen åpenbar toksisitet in vitro, men forhindret virus indusert CPE og produktiv viral livssyklus, er det viktig å karakterisere dens MoA 2. Vi har satt i gang en slik karakteristikk ved å utføre TOA assay for å bestemme den mulige trinn (e) av viral livssyklus som påvirkes av den antivirale. Vanligvis ble antiviral forbindelse tilsatt til cellene ved forskjellige tider før-eller etter-virus-infeksjon. Dersom antivirale ble tilsatt til de infiserte cellene selv legge til dens target step i løpet av infeksjon, vil det resultere i lavere aktivitet sammenlignet med den som ble tilsatt før trinnet. Således er TOA studie kritisk for å bestemme den antivirale effekt av en forbindelse, og dens potensielt mål, enten på den virale livssyklus, eller vertsmaskiner som er involvert i den virale livssyklusen.
For alle tre analysene, ble celle levedyktighet bestemmes ved hjelp av CTG kit etter produsentens anvisninger fem. Denne deteksjonssystem utganger tilstrekkelig luminescensparametere signaler som kunne analyseres ved hjelp av ulike in-house software. Hver analyse ble validert og utført i det minste i tre eksemplarer med åtte kopier. For alle de innhentede data, ble tre parametere, inkludert normalen (AVE), standardavvik (STDEV), og co-effektiv variasjon (CV) analysert for å fastslå robusthet av analysen. Når robustheten av analysen er fastsatt, vil dataene bli ytterligere analysert og plottet ved hjelp av ulike biostatics og grafiskc verktøy to.
Protocol
Representative Results
Discussion
For den innledende identifisering av antivirale hits, er en av de viktigste trinnene for antiviral medisiner og utvikling for å utvikle robuste analyser, som inkluderer å velge en målbar markør, utvikle en enkel protokoll, skaffe tilstrekkelige signaler og mindre enn 10% CV. De fleste biokjemiske eller cellebaserte skjermer er utformet for å gi en kjemisk utgangspunktet basert på den mest robuste, enkle og rimelige analyse, på grunn av den ønskede reproduserbarhet i screeningprosessen og potensielt store antall …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av stipend 1R03MH08127-01 og 7R03MH08127-02 fra NIH til Q. Li, og av effekten midler fra Institutt for indremedisin ved UAB til Q. Li. Støtte fra Molette Fondet og Auburn University er verdsatt. Vi takker også de tekniske assistanser fra Ms Pulin Che og Mr. Volodymyr Musiienko i løpet av arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
