Tre analyser, bland annat cytopatisk effekt (CPE)-baserad analys, analys dos-respons och Time-of-Addition (TOA)-analys har utvecklats, optimerad, validerade och används för att identifiera nya antivirala läkemedel mot bluetongue-virus (BTV), samt för att fastställa den möjliga mekanismen-av-åtgärd (MoA) för nyligen identifierade antivirala medel.
För att identifiera potentiella antivirala medel mot BTV, har vi utvecklat, optimeras och valideras tre analyser som presenteras här. CPE-baserade analysen var den första analys utvecklad för att utvärdera om en förening uppvisade någon antiviral effekt och har använts för att screena stora substansbibliotek. Under tiden kan cytotoxiciteten hos antiviraler också utvärderas med användning av CPE-baserad analys. Analysen dosrespons var utformad för att bestämma området för effektiviteten för den valda antiviral, det vill säga 50% inhiberande koncentration (IC50) eller effektiva koncentrationen (EC50), såväl som dess spann av cytotoxicitet (CC50). TOA-analysen användes för den initiala MoA undersökning för att fastställa den bakomliggande mekanismen av de nya antivirala läkemedel under BTV viral livscykel eller den eventuella effekten på värd cellulära maskineri. Dessa analyser är viktiga för utvärderingen av antiviral effekt i cellodlingssystem, och har använts för våra senaste undersökningar lederning till att identifiera ett antal nya antivirala läkemedel mot BTV.
BTV är en prototyp dubbelsträngat RNA-virus i släktet orbi, familj Reoviridae. BTV är en av de viktigaste sjukdomar av tamboskap, bland får, getter, nötkreatur och andra husdjur, med $ 3000000000 / år förlust världsomspännande 1,2. Den exotiska BTV serotyp är en viktig animaliska patogener anges i "USDA hög risk Boskap Pathogens." Nyligen återväxande av BTV har orsakat ett stort utbrott av sjukdomen hos nötkreatur och får i flera länder i norra Europa 3,4. Som ett resultat av dess ekonomiska betydelse och som modellsystem, har BTV varit föremål för omfattande molekylära, genetiska och strukturella studier, och flera vacciner har utvecklats. Men på grund av bristen på lämpliga analyser för antiviral läkemedelsupptäckt, det finns inga antivirala läkemedel tillgängliga mot BTV.
I en nyligen hög throughput screening (HTS) kampanj med hjälp BTV som modellsystem, vi developed, optimeras och valideras en CPE-baserad analys för att identifiera potentiella bredspektrum antivirala läkemedel mot arbovirus 5. CPE-baserad analys är ett välkänt test som har använts i antiviral läkemedelsutveckling mot ett antal virus som framkallade en snabb och observer CPE / apoptos 5-7. I vårt system, posta BTV-infektion är CPE uppenbart i vertebratceller, inklusive HeLa, BSR, och HEK 293T 8. BTV-inducerad CPE skulle kunna övervakas och kvantifieras med hjälp av olika metoder cellviabiliteten upptäckt, inklusive CellTiter Glo cellviabiliteten reagenssats (CTG-kit) 9. Detta kit bestämmer antalet livsdugliga celler i odling baserat på kvantifiering av cellulära ATP presenteras, vilket signalerar närvaron av metaboliskt aktiva levande celler. Under optimala förhållanden, CPE-baserad analys som presenteras här visade sin genomförbarhet med "blanda och mäta" ett steg-protokollet, och flexibilitet med stabila självlysande signaler. Samtidigt toxiska föreningar redusiering cellviabiliteten kommer att uteslutas i denna CPE-baserad analys. CPE-baserad analys visade sin robusthet och tillförlitlighet för antiviral läkemedelsutveckling mot BTV, och har använts för att screena NIH Molekylära bibliotek Small Molecule arkiv (MLSMR), vilket leder till identifiering av sex nya kluster av potentiella antiviral blyförening (s ) 5.
När en potentiell antiviral förening har identifierats med användning av CPE-baserad analys, måste den utsättas för det tio-koncentration dos-respons-analys för att bestämma området för antiviral effekt och cytotoxicitet 2. Den antivirala effekten, representerad som den inhiberande koncentration 50% (IC50) eller den effektiva koncentrationen 50% (EC 50), är koncentrationen av ett läkemedel som inhiberar virusinducerad CPE halvvägs mellan baslinjen och maximum. Cytotoxiciteten av antivirala läkemedel, dvs den cytotoxiska koncentrationen 50% (CC 50), är koncentrationenav ett läkemedel som inducerar 50% av cytotoxicitet mellan baslinjen och max. Den selektiva index (SI), betecknas som 50% SI (SI 50) beräknas från CC 50 / IC 50 som bestämmer specificiteten av det antivirala mot virus-inducerad CPE. IC-50 (eller EG-50), CC-50 och SI-50 värden är kritiska åtgärder för att fastställa huruvida en antiviral förening som är potenta och selektiva för vidare läkemedelsutveckling.
När ett antiviralt visade ingen uppenbar toxicitet in vitro, men förhindras virusinducerad CPE och produktiv viral livscykel, är det viktigt att karakterisera dess MoA 2. Vi initierade en sådan karaktärisering genom att utföra ToA analys för att bestämma den möjliga steg (er) av viral livscykel som påverkas av det antivirala. Generellt var antivirala föreningen sattes till celler vid olika tidpunkter före eller efter-virusinfektion. Om antivirala läkemedel lades till de infekterade cellerna posta till sitt mål step under loppet av infektion, skulle det resultera i lägre aktivitet jämfört med den som tillsattes före steget. Således är ToA studie avgörande för att bestämma antiviral effekt av en förening, och dess potentiellt mål, antingen på den virala livscykeln eller värd maskiner inblandade i den virala livscykeln.
För samtliga tre analyser, var cellviabiliteten bestämdes med användning av CTG kit efter tillverkarens instruktioner 5. Denna upptäckt Systemet matar tillräckliga luminiscens signaler som kan analyseras med hjälp av olika interna program. Varje analys validerades och utfört minst tre exemplar med åtta kopior. För alla de erhållna data har tre parametrar, inklusive medelvärdet (AVE), standardavvikelse (STDAV) och koefficient variation (CV) analyseras för att bestämma tillförlitligheten hos analysen. När robustheten i analysen har fastställts, kommer data att analyseras ytterligare och ritas med olika biostatics och graphic verktyg 2.
För den första kartläggningen av antivirala hits, är en av de viktigaste stegen för antiviral läkemedelsforskning och utveckling för att utveckla kraftfulla analyser, vilket inkluderar att välja en mätbar markör, utveckla ett enkelt protokoll, få tillräckligt med signaler och mindre än 10% CV. De flesta biokemiska eller cellbaserade skärmar är utformade för att ge en kemisk startpunkt baserad på den mest robusta, enkla och billiga test, beroende på önskad reproducerbarhet i urvalsprocessen och det pot…
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av bidrag 1R03MH08127-01 och 7R03MH08127-02 från NIH till Q. Li, och av effekterna medel från Institutionen för medicin vid UAB till Q. Li. Stöd från Molette fonden och Auburn University är uppskattad. Vi tackar också de tekniska assistans från Ms Pulin Che och Mr Volodymyr Musiienko under arbetet.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
BSR cell | Developed in house | ||
Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |