粘膜細菌感染に応答して好中球トランス上皮移動は、上皮損傷および臨床疾患に寄与する。この現象を調整する分子機構の解明に向けた研究を容易にするために、トランスウェルフィルター上で成長した病原体、ヒト好中球、偏光ヒト上皮細胞層を組み合わせた in vitro モデルが開発されました。
粘膜表面は、病原性生物に対する保護障壁として機能します。自然免疫応答は、主に好中球の炎症性細胞を移行させる組織の浸潤につながる病原体を感知すると活性化される。このプロセスは、過剰な場合や未解決の状態で保持されている場合、組織に破壊的になる可能性があります。 培養イン ビトロ モデルは、病原体誘導性好中球トランス上皮移動に関与する独自の分子機構を研究するために利用することができる。このタイプのモデルは、実験設計において、病原体、上皮バリア、または好中球の制御された操作の機会を持つ汎用性を提供します。透過性トランスウェルフィルター上で成長した偏光上皮単層の有端表面の病原性感染は、バソラテラル表面に適用される好中球の有端な経上皮移動に生理学的に関連するバソラターレを扇動する。本明細書に記載の in vitro モデルは、病原性 P.緑素吸 虫(PAO1)に感染した偏光肺上皮単層を横切って好中球の移動を実証するために必要な複数のステップを示す。ヒト由来肺上皮細胞による透過性トランスウェルの播種および培養は、全ヒト血液からの好中球の単離およびPAO1および非病原性K12 大腸菌 (MC1000)の培養と共に記載されている。 病原性感染に応答して動員された好中球の移行過程および定量分析は、陽性および陰性対照を含む代表的なデータで示されている。この インビトロ モデルシステムは、他の粘膜表面に操作し、適用することができます。過剰好中球浸潤を伴う炎症反応は、宿主組織に破壊的であり、病原性感染がない場合に起こり得る。本明細書に記載の インビトロ 共培養アッセイシステムの実験的操作を通じて好中球トランス上皮移動を促進する分子機構をよりよく理解することは、炎症性疾患と同様に感染性の様々な粘膜の範囲に対する新しい治療標的を同定する重要な可能性を有する。
粘膜表面は、環境1,2に広がった外部の脅威に対する保護を提供する物理的および免疫学的障壁として機能する。この保護上皮障壁は、病原性生物が2に侵入すると損なわれる可能性がある。細菌病原体の場合、この遭遇はしばしば自然免疫系を活性化し、好中球2-4として知られている最初の応答者顆粒球の急速な動員を引き起こすことによって炎症過程を誘発する。好中球の採用を促進する化学戦術剤は、問題の病原体2-4の宿主を取り除こうとする粘膜上皮細胞によって部分的に産生される。粘膜上皮表面の過剰または未解決の好中球浸潤は、重大な病理1,5を引き起こす可能性がある。これは、抗細菌性好中球兵器5-7によって引き起こされる非特異的組織損傷の結果である。このような場合、好中球の細菌クリアランス能力は、感染性の侮辱の間に宿主組織の破壊によって影を落とす。 保護上皮バリア機能の破壊は、微生物および/または毒素への基礎組織の暴露の増強をもたらし、病態8,9をさらに悪化させる。これらの結果は、肺および消化管1,5を含む多臓器系で観察することができる。さらに、喘息の重篤な発作、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、および炎症性腸疾患(IBD)などの非感染性炎症性疾患は、過剰好中球応答4,5,10-12による粘膜上皮バリアの病理学的違反によって特徴付けられます。
粘膜感染後の好中球の採用の複雑なプロセスは、いくつかの区画化ステップ1,5,13,14を伴う。第一に、好中球は、経内皮移動を促進する一連の細胞間相互作用を介して循環から逸脱しなければならない1,13。好中球は次に細胞外マトリックス1,14を含む既存の間質空間をナビゲートする。感染した粘膜の内腔に到達するには、好中球は上皮バリア1,4,5を越えて移動しなければならない。この複雑な多段階現象は、多くの場合、生体 内 感染の動物モデル15を用いて集合的に調査される。このようなモデルは、ケモカイン、接着分子、または全体的なプロセスに関与するシグナル伝達経路などの特定の因子の必要性を確立するのに有用であるが、各区分化ステップ16に対して重要な分子寄与を解決するのには大きく不十分である。好中球のトランス内皮、トランスマトリックス、またはトランス上皮移動をモデル化したイン ビトロ 系の共培養は、この点1,14、16、17において特に有用であった。
病原性感染に応答して好中球トランス上皮移動を担う機構を解読することを目的とした強固な共培養アッセイシステムが開発された。このモデルは、分極化したヒト上皮細胞層の有端表面を細菌病原体に感染させ、続いて新たに単離されたヒト好中球をバソラショナル表面18〜22に適用することを含む。好中球は、病原性感染後に分泌される上皮由来の化学戦術産物に応答して上皮バリアを越えて移動する18,21-23.このモデルシステムは、適切な組織特異的細菌病原体に曝露された腸及び肺上皮培養物を用いて採用されており、粘膜感染時の好中球の採用過程において重要である可能性が高い新しい分子機構を明らかにした3,8,19,24-28。この in vitro の共培養モデルの強みは、還元的アプローチにより、研究者が十分に制御され、高度に再現性の高い、かなり安価なシステムで病原体、上皮バリア、および/または好中球を実験的に操作することを可能にすることです。このアプローチから収集された洞察は、 生体内 感染モデル22,29,30を用いた好中球募集中の区分化事象の集中分析を効果的に行うために活用することができる。
本稿では、病原体誘導性好中球越上皮移動を探求するために、この再現可能なモデルを確立するために必要な複数のステップを示す。病原体 シュードモナス・エルギノーザ に感染した肺上皮障壁はこの記事で紹介されています。しかし、他の組織上皮および病原体は、軽微な修飾で置換することができる。逆コラーゲン被覆透過性トランスウェルフィルター上の偏光性肺上皮細胞層の播種および培養は、病原性 P.緑素吸除の 成長および全血からの好中球の単離と同様に、本明細書で詳述される。これらの成分を組み合わせて病原体誘導性好中球トランス上皮移動を観察する方法は、適切な陽性および陰性制御と共に提示され、再現可能なアッセイを確立する。このアプローチの多様性は、病原体誘導性好中球トランス上皮移動の様々な側面を調べるための、文献における特定の研究を参照して議論される。
粘膜上皮表面を越えて好中球の移動は、細菌病原体3に感染した後の疾患病理における共通の特徴である。本明細書に記載された方法論は、細菌感染によって引き起こされる炎症過程の特徴をモデル化するヒト細胞由来 のインビトロ 共培養アッセイシステムを用いて、この離散事象を実験的に分離するための迅速で簡単なアプローチを提供する。このシステムは、もともと …
The authors have nothing to disclose.
この作業は、NIH(1 R01 AI095338-01A1)によって財政的にサポートされました。
NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |