칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트
Summary
우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.
Abstract
우리는 스트레스 기반 환경에서 항생제 감수성 검사를 위한 신속한 미세 유체 방법을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건에서 살아남습니다. 이 방법의 뒤에 가설은 새로운: 항생제의 표적인 생화확적인 통로의 스트레스 활성화는, 항생제 감수성 시험을 가속화할 수 있습니다. 표준 항생제 감수성 검사 방법에 비해, 속도 제한 단계 – 세균 성장 – 항생제 적용 중에 생략된다. 이 방법의 기술적 구현은 표준 기술과 혁신적인 접근 방식의 조합입니다. 이 방법의 표준 부분에는 세균 배양 프로토콜, 폴리디메틸실록산(PDMS)의 미세 유체 채널 정의, 형광을 이용한 세포 생존 가능성 모니터링, 박테리아 계수에 대한 배치 이미지 처리 등이 포함됩니다. 이 방법의 혁신적인 부분은 기계적 응력 적용을 위한 배양 매체 흐름의 사용, 박테리아를 손상시키지 만 손상시키지 않는 효소의 사용, 세균 부착을 위한 미세어기 기판의 사용에 있다. 개발 된 플랫폼은 항생제 및 비 항생제 관련 약물 개발 및 테스트에 사용할 수 있습니다. 표준 세균현절 실험과 비교하여, 약물의 효과는 조절 기간 동안 반복적으로 켜고 끌 수 있다. 동일한 세균 집단의 반복적인 관찰은 동일한 실험의 과정을 통해 가능하다.
Introduction
세균성 저항의 상승은 최후의 수단의 우리의 약을 보호하기 위하여 빠른 표현형 기지를 둔 항생제 감수성 시험에 대한 필요를 강화합니다. 표준 감수성 검사는 여러 (8-24) 시간이 걸리는 항생제의 존재에서 세균 성장 억제에 기초한다. 우리는 항생제의 작용을 가속화하기 위하여 생합성 통로의 긴장 활성화에 의존하는 미세유체 플랫폼에 새로운 항생제 감수성 시험을 개발했습니다.
미세 유체 척도에서 항생제 감수성 검사는 박테리아의 작은 숫자를 필요로하기 때문에 효과적인 샘플 사용의 이점을 수행합니다. 또한, 미세 유체 장치는 다중 조건1,2에서여러 샘플을 테스트하기 위해 멀티플렉스될 수 있다. 최근에는 항생제 감수성 검사를 위한 다수의 미세유체 방법이3-9로보고되고 있다. 이러한 방법에서, 박테리아는 나노 및 피콜리터 물방울3,7,미세 유체 채널4-6,8의전체 부피에서, 또는 채널9의바닥 표면에 전기적으로 국한된 단일 박테리아로서 재배된다. 이 시험은 미세 유체 채널에서 수행되지만, 그들은 모두 기존의 방법과 유사한 항생제의 존재와 부재에서 미생물 성장을 모니터링합니다. 성장 측정은 광학 밀도, pH 민감한 염료 또는 밝은 필드/위상 대비 또는 형광 이미지를 통해 수행됩니다. 이러한 테스트 중 일부는 전통적인 방법 보다 빠른, 그들은 각각 수동적으로 항생제 저항을 감지. 즉, 이러한 방법은 여전히 최종 판독으로 세균 성장을 기다려야 하는 사용자를 요구합니다.
대조적으로, 우리는 항생제에 민감한 생화학적 경로를 활성화하기 위해 전단과 효소 스트레스의 조합을 사용하는 방법을개발했다(10). 그 항생제로 스트레스 박테리아에 도전하는 것은 더 빠른 감수성 시험을 만듭니다. 항생제에 저항하는 박테리아는 스트레스가 많은 조건을 견딜 수 있습니다. 반면에, 민감성 박테리아는 결합된 응력에 의해 급속하게 죽습니다. 형광 죽은 세포 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 측정 된 1 시간 후에 세포 사멸의 비율은 박테리아의 표현형을 정의합니다 (저항성 대 민감성).
우리의 방법의 성공적인 구현을 위해, 박테리아는 미세 유체 채널의 바닥 표면에 고정되어야합니다. 이러한 방식으로 박테리아는 단일 평면에서 현미경으로 다양한 스트레스를 받고 동시에 심을 수 있습니다. 코팅 된 현미경 유리 슬라이드는 박테리아 고정에 사용됩니다. 슬라이드는 비특이적 단백질 결합을 위해 에폭화물 군을 가진 제조 업체에 의해 미리 코팅됩니다. 세균성 표면 단백질에 이러한 에산화물의 비특이적 결합은 박테리아를 슬라이드 표면에 공유합니다.
균주는 항생제의 부재 (대조군) 및 존재 (실험)에서 동일한 조건 (전단 + 효소 스트레스)에서 테스트됩니다. 각 채널의 위상 대비 및 형광 현미경 사진은 1 시간 동안 2 분마다 자동으로 촬영됩니다. 저항 지정은 그 때 대조군 채널에 있는 죽은 박테리아의 백분율을 대조채널에 있는 것과 비교하여 만들어집니다. 1 시간 후에, 세포 죽음 백분율이 1% 보다 큰 견본은 저항의 표시인 동안, 영향을 받기 쉬운 것으로 간주됩니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
미세 유체 채널은 PDMS에 정의되며, 이는 미세 유체장치(11)에대한 선택의 재료이다. PDMS는 광범위한 파장, 생체 적합성, 불활성, 가스에 투과성이 있는 광활한 범위에서 광학적으로 투명하며 액체에 대한 투과성이 낮습니다. 따라서 이러한 실험에 적합합니다.
기계적/전단 응력은 고정된 박테리아를 통해 실온 매체의 흐름에 의해 생성됩니다. (참고: 미디어를 37°C로 온난화하는 것은 분석 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다.) 자동 주사기 펌프는 1 ml/분의 유속으로 미세 유체 채널(200 μm x 400 μm)을 통해 미디어(사구 얼룩 +/-항생제 포함)를 강제하여 6.25kPa의 전단 력 또는 전단 속도 6,000초-1을제공합니다. 이 비율은 황색포도상구균에이전에 연구된 전단 응력과 같거나 초과합니다.
효소, 리소스타핀은 황색포도상구균 세포벽에 직접적인 손상을 일으키기 때문에 예비 실험을 위해 선택되었다. 리소스타핀(0.7 ng/ml)의 농도는 세균성 세포벽 손상을 유발하기에 충분했지만, 실험 기간 내에 항생제 없이 세균세포사멸을 유발하는 것만으로는 충분하지 않았다. Lysostaphin세균성 감수성의 정확한 지정을 위해 필요하지 않습니다 그러나 그것은 영향을 받기 쉬운 긴장에 있는 증가한 세포 죽음으로 이끌어 내는 결과를 증강않습니다. 대조적으로, 전단 응력은 분석 기능에 중요합니다. 메티실린에 민감한 황색포도상구균균이 흐름이 없는 경우 리소스타핀과 옥사실린으로 치료될 때, 실험 과정에서 세포 사멸이 기록되지 않는다.
세포 생존가능성은 형광사세포얼룩(12)으로모니터링된다. 염료의 선택은 손상된 세포만 선택적으로 얼룩지게 하는 능력, 살아있는 세포에 대한 독성, 그리고 낮은 배경 형광에 기초하여, 추가 단계없이 세포 미디어에 직접 첨가할 수 있었습니다. 0.25 μM의 형광염 염료 농도의 선택은 형광 분광광에 대한 1.6초 노출 시간 동안 허용 가능한 신호 수준을 달성하기 위한 것이었다.
베타 락탐, 옥사실린, 우리의 예비 연구에서 사용 되었다. 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA) 종은 옥사실린에 내성이 있으며 실험 기간 내에 상당한 세포 사멸을 나타내지 않습니다. 50 μg/ml의 농도는 예비 연구에서 결정되었다. 항생제의 낮은 농도는 저항과 영향을 받기 쉬운 긴장 사이 더 적은 분리를 주었습니다, 높은 농도는 실험 결과에 있는 감사한 다름을 일으키는 원인이 되지 않는 동안.
우리는 이전에 세포벽 생합성을 억제하는 항생제로 세균성세포벽(13)에 직접 영향을 미치는 기계적 및 효소 응력을 결합한 시험의 성공적인 개발에 대해보고하였다 14,15. 이러한 원칙 증명 실험은 MRSA 및 메티실린에 민감한 S. 아우레우스(MSSA)의 패널에서 수행되었다. 그러나, 적절 한 실험 매개 변수의 선택으로, 우리의 방법은 박테리아의 여러 종 및 항생제의 여러 클래스에 적용 해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 메티실린에 민감하고 메티실린 내성 황색포도상구균 10균을가진 실험 세트에서 검증되고 최적화되었다. 따라서 수정없이이 프로토콜은 세균성 세포 벽 생합성에 영향을 미치는 작용 메커니즘을 가진 S. 아우레우스 및 기타 항생제의 다른 균주에 직접 적용해야합니다. S. 아우레우스 이외의 박테리아 유형은 스트레스 매개 변수의 변이를 요구할 수 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제조 혁신을위한 Fraunhofer 센터의 엔지니어와 학생들에게 감사드립니다. 실험 시스템의 설계, 가공 및 자동화를 돕기 위해 안드레아스 프린젠, 홀거 워스, 더그 포스, 데이비드 차긴, 수동 슈 박사에게 감사드립니다. 줄리아 쿠카르츠, 멜라니 짐머만, 니코 크라에츠마르, 팀 검벨, 조쉬 비야누에바, 미노리 시미즈, 카타르지나 쿨리가 실험 프로토콜 및 데이터 수집 테스트에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 셀 프로파일러의 이미지 분석 루틴의 개발에 도움을 하버드와 MIT의 넓은 연구소에서 이미징 플랫폼의 박사 앤 E. 목수와 마크 앤서니 브레이 박사를 인정합니다. 설명된 이 프로젝트는 국립 알레르기 및 감염증 연구소의 R21AI079474 및 1R01AI101446에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 알레르기 및 전염병 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트는 또한 프라운호퍼 미국에 의해 지원되었다.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
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