Stressindusert antibiotika følsomhetstesting på en brikke
Summary
Vi har utviklet en mikrofluidisk plattform for rask antibiotika mottakelighet testing. Væske overføres ved høye hastigheter over bakterier immobilisert på bunnen av en mikrofluidisk kanal. I nærvær av stress og antibiotika dør mottakelige bakteriestammer raskt. Imidlertid kan resistente bakterier overleve disse stressende forholdene.
Abstract
Vi har utviklet en rask mikrofluidisk metode for antibiotika mottakelighetstesting i et stressbasert miljø. Væske overføres ved høye hastigheter over bakterier immobilisert på bunnen av en mikrofluidisk kanal. I nærvær av stress og antibiotika dør mottakelige bakteriestammer raskt. Imidlertid overlever resistente bakterier disse stressende forholdene. Hypotesen bak denne metoden er ny: stressaktivering av biokjemiske veier, som er mål for antibiotika, kan akselerere antibiotikafølsomhetstesting. Sammenlignet med standard antibiotika mottakelighet testmetoder, er det hastighetsbegrensende trinnet – bakterievekst – utelatt under antibiotikaapplikasjon. Den tekniske implementeringen av metoden er i en kombinasjon av standardteknikker og innovative tilnærminger. Standarddelene av metoden inkluderer bakteriekulturprotokoller, definering av mikrofluidiske kanaler i polydimetylsiloksan (PDMS), celle levedyktighetsovervåking med fluorescens og batchbildebehandling for bakterietelling. Innovative deler av metoden er i bruk av kulturmediestrøm for mekanisk stressapplikasjon, bruk av enzymer for å skade, men ikke drepe bakteriene, og bruk av mikroarray substrater for bakteriell vedlegg. Den utviklede plattformen kan brukes i antibiotika og ikke-antibiotisk relatert legemiddelutvikling og testing. Sammenlignet med standard bakterielle suspensjonseksperimenter, kan effekten av stoffet slås av og på gjentatte ganger over kontrollerte tidsperioder. Repeterende observasjon av samme bakteriepopulasjon er mulig i løpet av samme eksperiment.
Introduction
Økningen av bakteriell resistens intensiverer behovet for raske fenotypebaserte antibiotikafølsomhetstester for å beskytte våre legemidler fra siste utvei. Standard følsomhetstester er basert på bakteriell veksthemming i nærvær av antibiotika som tar flere (8-24) timer å fullføre. Vi har utviklet en ny antibiotisk følsomhetstest på en mikrofluidisk plattform som er avhengig av stressaktivering av biosyntetiske veier for å akselerere virkningen av antibiotika.
Antibiotiske følsomhetstester i mikrofluidisk skala har fordelen av effektiv prøvebruk, siden de krever et lite antall bakterier. I tillegg kan mikrofluidiske enheter multiplekses for å teste flere prøver under flere forhold1,2. Nylig har en rekke mikrofluidiske metoder for antibiotika mottakelighet testing blitt rapportert3-9. I disse metodene dyrkes bakterier inne i nano- og picoliterdråper3,7, i hele volumet av den mikrofluidiske kanalen4-6,8, eller som enkeltbakterier elektrisk lokalisert til bunnen av kanalen9. Selv om disse testene utføres i mikrofluidiske kanaler, overvåker de alle mikrobiell vekst i nærvær og fravær av antibiotika som ligner tradisjonelle metoder. Vekstmålinger tas via optisk tetthet, pH-sensitive fargestoffer eller lyse felt-/fasekontrast- eller fluorescensbilder. Selv om noen av disse testene er raskere enn tradisjonelle metoder, oppdager de hver passivt antibiotikaresistens. Med andre ord krever disse metodene fortsatt at brukeren venter på bakterievekst som den endelige avlesningen.
I motsetning har vi utviklet en metode som bruker en kombinasjon av skjær og enzymatisk stress for å aktivere antibiotikafølsomme biokjemiske veier10. Å utfordre de stressede bakteriene med disse antibiotika skaper en raskere følsomhetstest. Bakterier som er resistente mot antibiotika er i stand til å motstå de stressende forholdene. Mottakelige bakterier, derimot, blir raskt drept av de kombinerte påkjenningene. Prosentandelen av celledød etter en time, målt ved mikroskopi ved hjelp av en fluorescerende dødcelleflekk, definerer bakteriens fenotype (resistent vs. mottakelig).
For vellykket implementering av vår metode må bakterier immobiliseres på bunnen av den mikrofluidiske kanalen. På denne måten kan bakterier bli utsatt for ulike påkjenninger og samtidig avbildet under et mikroskop i et enkelt plan. En belagt mikroskop glass lysbilde brukes til bakterier immobilisering. Lysbildet er forhåndsbestrøket av produsenten med epoksidgrupper for ikke-spesifikk proteinbinding. Den ikke-spesifikke bindingen av disse epoksidene til bakterielle overflateproteiner fester bakteriene kovalent til glideoverflaten.
Stammer testes under identiske forhold (skjær + enzymatisk stress) i fravær (kontroll) og tilstedeværelse (eksperiment) av antibiotika. Fasekontrast- og fluorescensmikroskopbilder av hver kanal tas automatisk hvert annet minutt i en time. Resistensbetegnelser gjøres deretter ved å sammenligne prosentandelen av døde bakterier i den eksperimentelle kanalen med de som er tilstede i kontrollkanalen. Etter en time anses en prøve med en celledødsprosent større enn 1% som mottakelig, mens mindre enn 0,5% død indikerer motstand. Prosenter som faller mellom disse to avskjæringene anses som ubestemte, og prøven må testes på nytt.
Mikrofluidiske kanaler er definert i PDMS, som er et valgmateriale for mikrofluidiske enheter11. PDMS er optisk gjennomsiktig i et bredt spekter av bølgelengder, biokompatible, inert, gjennomtrengelige for gasser og har lav permeabilitet til væsker; Derfor er det godt egnet for disse eksperimentene.
Mekanisk/skjærspenning skapes av strømmen av romtemperaturmedier over de immobiliserte bakteriene. (Merk: Oppvarming av mediet til 37 °C har ingen signifikant effekt på analyseresultatet.) Automatiserte sprøytepumper tvinger medier (som inneholder dødcelleflekk +/- antibiotika, samt valgfrie enzymatiske stressorer) gjennom mikrofluidiske kanaler (200 μm x 400 μm) med en strømningshastighet på 1 ml/min for å gi 6,25 kPa skjærkraft eller en skjærhastighet på 6000 sek-1. Denne frekvensen er lik eller overstiger tidligere studerte skjærspenninger på Staphylococci.
Enzymet, lysostaphin, ble valgt for foreløpige eksperimenter fordi det forårsaker direkte skade på Staphylococcus cellevegg. Konsentrasjonen av lysostaphin (0,7 ng/ml) var tilstrekkelig til å forårsake bakteriell celleveggskade, men ikke tilstrekkelig til å forårsake bakteriell celledød uten antibiotika i forsøkets tidsramme. Lysostaphin er ikke nødvendig for riktig betegnelse av bakteriell følsomhet, men det øker utfallet, noe som fører til økt celledød i mottakelige stammer. Skjærstress er derimot avgjørende for analysefunksjonen. Når methicillin-sensitive Staphylococcus aureusstammer behandles med lysostaphin og oksacillin i fravær av strømning, registreres ingen celledød i løpet av eksperimentet.
Celle levedyktighet overvåkes med en fluorescerende død celleflekk 12. Valget av fargestoffet var basert på dets evne til selektivt å flekke bare skadede celler, dets ikke-toksisitet til levende celler, og dens lave bakgrunnsfluorescens, noe som tillot direkte tillegg til cellemediet uten ytterligere trinn. Valget av en fluorescerende fargekonsentrasjon på 0,25 μM var å oppnå akseptable signalnivåer i løpet av en 1,6 sek eksponeringstid for fluorescenseksitasjonslys.
Beta-laktam, oxacillin, ble brukt i våre foreløpige studier. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) arter er resistente mot oxacillin og vil ikke vise noen merkbar celledød i tidsrammen for eksperimentet. Konsentrasjonen på 50 μg/ml ble bestemt i de foreløpige studiene. Lavere konsentrasjoner av antibiotika ga mindre separasjon mellom resistente og mottakelige stammer, mens høyere konsentrasjoner ikke forårsaket en merkbar forskjell i eksperimentelle utfall.
Vi har tidligere rapportert om vellykket utvikling av en test som kombinerer mekaniske og enzymatiske påkjenninger som direkte påvirker bakteriecelleveggen13 med et antibiotika som hemmer celleveggbiosyntese14,15. Disse prinsippbevis-eksperimentene ble utført på et panel av MRSA og methicillin-sensitive S. aureus (MSSA). Men med valg av riktige eksperimentelle parametere, bør vår metode gjelde for flere arter av bakterier og flere klasser av antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen ble validert og optimalisert i et sett med eksperimenter med methicillin-sensitive og methicillinresistente Staphylococcus aureusstammer 10. Derfor bør denne protokollen uten modifikasjon være direkte anvendelig for andre stammer av S. aureus og andre antibiotika med virkningsmekanismer som påvirker bakteriell celleveggbiosyntese. Andre bakterietyper enn S. aureus kan kreve variasjon i stressparametrene: løselige (enzymatiske) og mekaniske påkjenninge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker ingeniørene og studentene ved Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. For å ha hjulpet til med design, maskinering og automatisering av det eksperimentelle systemet, takker vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin og Dr. Sudong Shu. Vi takker Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu og Katarzyna Kuliga for hjelp med testing av eksperimentelle protokoller og datainnsamling. Vi anerkjenner Dr. Anne E. Carpenter og Mark-Anthony Bray fra Imaging Platform ved Broad Institute of Harvard og MIT for å få hjelp til utvikling av bildeanalyserutinen i CellProfiler. Prosjektet som ble beskrevet ble delvis støttet av Awards R21AI079474 og 1R01AI101446 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Prosjektet ble også støttet av Fraunhofer USA.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
