Стресс-индуцированной антибиотиков Восприимчивость Тестирование на чип
Summary
Мы разработали микрофлюидную платформу для быстрого тестирования на чувствительность к антибиотикам. На высоких скоростях жидкость передается бактериям, обездвиженным на дне микрофлюидного канала. При наличии стресса и антибиотиков, восприимчивые штаммы бактерий умирают быстро. Тем не менее, устойчивые бактерии могут выжить в этих стрессовых условиях.
Abstract
Мы разработали быстрый микрофлюидный метод тестирования на чувствительность к антибиотикам в условиях стресса. На высоких скоростях жидкость передается бактериям, обездвиженным на дне микрофлюидного канала. При наличии стресса и антибиотиков, восприимчивые штаммы бактерий умирают быстро. Тем не менее, устойчивые бактерии выживают в этих стрессовых условиях. Гипотеза, стоящая за этим методом, новаяая: стресс-активация биохимических путей, которые являются объектами антибиотиков, может ускорить тестирование на восприимчивость к антибиотикам. По сравнению со стандартными методами тестирования на чувствительность к антибиотикам, ограничивающий скорость шаг – рост бактерий – опускается во время применения антибиотиков. Техническое внедрение метода заключается в сочетании стандартных методов и новаторских подходов. Стандартные части метода включают протоколы бактериальной культуры, определение микрофлюидных каналов в полидиметилсилоксане (PDMS), мониторинг жизнеспособности клеток с флуоресценцией и обработку пакетного изображения для подсчета бактерий. Инновационные части метода в использовании культуры потока средств массовой информации для механического применения стресса, использование ферментов для повреждения, но не убить бактерии, и использование микроаррей субстратов для бактериальной привязанности. Разработанная платформа может быть использована в разработке и тестировании антибиотиков и неантибиотических препаратов. По сравнению со стандартными экспериментами бактериальной суспензии, эффект препарата может быть включен и выключен неоднократно в течение контролируемых периодов времени. Повторяющиеся наблюдения одной и той же бактериальной популяции возможно в ходе того же эксперимента.
Introduction
Рост бактериальной резистентности усиливает необходимость в быстрых тестах на восприимчивость к антибиотикам на основе фенотипа, чтобы защитить наши препараты последней инстанции. Стандартные тесты на восприимчивость основаны на ингибировании роста бактерий в присутствии антибиотиков, которые принимают несколько (8-24) часов для завершения. Мы разработали новый тест на восприимчивость к антибиотикам на микрофлюидной платформе, которая опирается на стресс-активацию биосинтетических путей для ускорения действия антибиотиков.
Тесты на восприимчивость к антибиотикам в микрофлюидной шкале имеют преимущество эффективного использования образца, поскольку они требуют небольшого количества бактерий. Кроме того, микрофлюидные устройства могут быть мультиплексированы для того, чтобы протестировать несколько образцов при несколькихусловиях 1,2. В последнее время, ряд микрофлюидных методов для тестирования на чувствительность к антибиотикам былизарегистрированы 3-9. В этих методах бактерии выращиваются внутри нано- и пиколитическихкапель 3,7,в полном объеме микрофлюидногоканала 4-6,8,или как одиночные бактерии, электрически локализованные на нижней поверхности канала9. Хотя эти тесты проводятся в микрофлюидных каналах, все они контролируют рост микробов в присутствии и отсутствии антибиотиков, аналогичных традиционным методам. Измерения роста проводятся с помощью оптических плотностей, чувствительных к рН красителей или яркого контраста поля/фазы или изображений флуоресценции. Хотя некоторые из этих тестов быстрее, чем традиционные методы, каждый из них пассивно обнаружить устойчивость к антибиотикам. Другими словами, эти методы по-прежнему требуют от пользователя ждать роста бактерий в качестве окончательного считыва.
В отличие от этого, мы разработали метод, который использует сочетание снятия снятия и энзиматический стресс для активации чувствительных к антибиотикам биохимическихпутей 10. Вызов подчеркнул бактерий с этими антибиотиками создает более быстрый тест восприимчивости. Бактерии, устойчивые к антибиотикам, способны выдерживать стрессовые условия. С другой стороны, восприимчивые бактерии быстро погибают от комбинированных стрессов. Процент клеточной смерти через час, измеряемый микроскопией с использованием флуоресцентного пятна мертвых клеток, определяет фенотип бактерий (резистентный против восприимчивых).
Для успешной реализации нашего метода бактерии должны быть обездвижены на нижней поверхности микрофлюидного канала. Таким образом, бактерии могут подвергаться различным стрессам и одновременно изображения под микроскопом в одной плоскости. Стеклянный слайд с покрытием микроскопа используется для иммобилизации бактерий. Слайд предварительно покрытием производителя с эпоксидными группами для неспецифического связывания белка. Неспецифическая привязка этих эпоксидов к бактериальным поверхностным белкам ковалентно прикрепляет бактерии к поверхности слайда.
Штаммы тестируются в одинаковых условиях (стрижка и энзиматический стресс) при отсутствии (контроле) и наличии (эксперименте) антибиотика. Фазовая контрастность и флуоресценция микроскопа фотографии каждого канала принимаются автоматически каждые две минуты в течение одного часа. Затем обозначения сопротивления сделаны путем сравнения процента мертвых бактерий в экспериментальном канале с теми, которые присутствуют в канале управления. После одного часа, образец с процентом смерти клетки больше чем 1% посчитан susceptible, пока меньш чем 0.5% смерть свидетельствует сопротивления. Проценты, которые падают между этими двумя отрезами, считаются неопределенными, и образец должен быть проверен еще раз.
Микрофлюидные каналы определяются в PDMS, который является материалом выбора для микрофлюидных устройств11. PDMS оптически прозрачна в широком диапазоне длин волн, биосовместима, инертна, проницаема для газов и имеет низкую проницаемость жидкостей; поэтому он хорошо подходит для этих экспериментов.
Механический/стрижка стресс создается потоком средств массовой информации комнатной температуры над обездвиженными бактериями. (Примечание: Потепление средств массовой информации до 37 градусов по Цельсию не имеет существенного влияния на результаты анализа.) Автоматизированные шприц насосы силу средств массовой информации (содержащий мертвые пятна клеток / – антибиотик, а также дополнительные энзиматические стрессоры) через микрофлюидные каналы (200 мкм х 400 мкм) при скорости потока 1 мл/мин, чтобы дать 6,25 кПа силы стрижки или скорость стрижки 6000сек -1. Этот показатель равен или превышает ранее изученные нагрузки с shear на Staphylococci.
Фермент, лизостафин, был выбран для предварительных экспериментов, потому что он вызывает прямое повреждение стенки клеток стафилококка. Концентрация лизостафина (0,7 нг/мл) была достаточной, чтобы вызвать повреждение стенок бактериальных клеток, но недостаточной, чтобы вызвать гибель бактериальных клеток без антибиотика в сроки эксперимента. Лизостафин не требуется для правильного обозначения бактериальной восприимчивости, но это увеличивает результат, что приводит к увеличению смертности клеток в восприимчивых штаммов. В отличие от этого, стресс стрижки имеет решающее значение для анализа функции. Когда метициллин чувствительных штаммов золотистого стафилококка лечатся лизостафином и оксациллином при отсутствии потока, клеточной смерти не регистрируется в течение эксперимента.
Жизнеспособность клеток контролируется с флуоресцентным пятном мертвыхклеток 12. Выбор красителя был основан на его способности избирательно окрашивать только поврежденные клетки, его нетоксичность для живых клеток, и его низкой фоновой флуоресценции, что позволило для его прямого добавления к клеточному смиреанию без дополнительных шагов. Выбор концентрации флуоресцентного красителя в 0,25 МКМ должен был достичь приемлемого уровня сигнала в течение 1,6 сек времени воздействия флуоресцентного возбуждения света.
Бета-лактам, оксациллин, был использован в наших предварительных исследованиях. Метициллин-устойчивые К. ауреус (MRSA) устойчивы к оксациллину и не покажут заметной гибели клеток в сроки эксперимента. В ходе предварительных исследований была определена концентрация 50 мкг/мл. Более низкие концентрации антибиотиков давали меньше разделения между устойчивыми и восприимчивыми штаммами, в то время как более высокие концентрации не вызывают заметной разницы в экспериментальных исходах.
Ранее мы сообщали об успешном разработке теста, который сочетает в себе механические и энзиматические стрессы, которые непосредственно влияют набактериальную клеточной стенки 13 с антибиотиком, который подавляет биосинтезклеточной стенки 14,15. Эти эксперименты были проведены на панели MRSA и метициллин чувствительных S. aureus (MSSA). Однако при выборе надлежащих экспериментальных параметров наш метод должен быть применим к нескольким видам бактерий и нескольким классам антибиотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол был проверен и оптимизирован в наборе экспериментов с метициллин-чувствительными и метициллин-устойчивыми штаммами золотистого стафилококка 10. Таким образом, этот протокол без изменений должен быть непосредственно применим к другим штаммам S. aureu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим инженеров и студентов Центра производственных инноваций Фраунгофера. За помощь в проектировании, обработке и автоматизации экспериментальной системы мы благодарим Андреаса Принцена, Хольгера Вирза, Дага Фосса, Дэвида Чаргина и доктора Судонг Шу. Мы благодарим Джулию Кукартц, Мелани Циммерманн, Нико Кракмар, Тима Гамбеля, Джоша Вильянуэва, Минори Симидзу и Катаржину Кулигу за помощь в тестировании экспериментальных протоколов и сбора данных. Мы признательны д-ру Энн Э. Карпентер и Марку-Энтони Брею (Mark-Anthony Bray) из платформы Imaging Platform в Институте Броуда Гарвардского университета и Массачусетского технологического института за помощь в разработке процедуры анализа изображений в CellProfiler. Описанный проект был частично поддержан наградами R21AI079474 и 1R01AI101446 от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института аллергии и инфекционных заболеваний или Национальных институтов здравоохранения. Проект также был поддержан фраунгофером США.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
