Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.
Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.
As junções de hiato são canais intercelulares que permitem a intercomunicação entre células vizinhas 1. Esta comunicação conecta duas ou mais células vizinhas, onde cada um contribui com um connexon ou hemichannel para formar o canal intercelular. Em células de mamíferos, o connexon é formado por seis conexinas, monómeros com quatro domínios transmembranares e um terminal de C e N dentro do citoplasma 2. As junções de hiato não só permitir o fluxo de iões, segundos mensageiros e pequenos metabolitos, mas também contribuir para muitas formas de comunicação celular em muitos processos fisiológicos, tais como a transmissão sináptica, a contracção cardíaca, crescimento e diferenciação celular 3, 4, 5, 6, 7, 8. Além disso as junções de hiato foram associados commuitas doenças incluindo cancro 9, 10, 11, atrofia muscular, algumas doenças genéticas e doenças desmielinizantes 12.
Este tipo de interferência intercelular pode ser avaliada através de vários métodos 13, 14, 15, 16. Neste artigo, vamos mostrar como realizar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas. Discute-se como preparar as células e a micropipeta, a utilização do micromanipulador e a injecção do corante Amarelo Lúcifer em uma linha de células epiteliais do timo. Normalmente, este procedimento experimental poderia ser analisados pela média de células ligadas à célula carregado com corante. Além disso, este método pode ser usado com outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a lacunajunções de corte, que é cerca de 1.000 daltons.
A fim de verificar a presença de junções de hiato funcionais intercelular, a utilização de marcadores, que são membrana impermeável, embora permeável por meio de canais intercelulares são necessários 16. Fluoresceína, o primeiro corante fluorescente para observar célula-a-célula de acoplamento 22, é permeável entre membranas não juncionais 3 e, por conseguinte, tem sido substituído por Lúcifer corante Amarelo 15.<…
The authors have nothing to disclose.
The authors dedicate this paper in honor of Prof. Gilberto Oliveira-Castro who introduced research in intercellular communication by gap junctions in Brazil. This work was funded by Capes, CNPQ and Faperj.
Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
PBS tablets | Sigma | P4417 | |
RPMI | Sigma | R4130 | |
Bovine fetal serum | Cultilab | ||
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Microscope | Nikon | TE-2000 | For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy |
vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |