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Article de méthode

Organite Transport en culture d' Drosophila Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

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DOI :

10.3791/50838

⸱

20 novembre 2013

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2IKERBASQUE, Basque Foundation for Science

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cellules S2 de drosophile et des neurones en culture sont de grands systèmes pour l'imagerie du transport motorisé organite in vivo. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour la culture des deux types de cellules, leur imagerie et d'analyse de transport.

Résumé

Des cellules S2 de Drosophila étalées sur une lamelle couvre-objet en présence de tous les longs processus non ramifiées de forme de médicaments de l'actine-dépolymérisation de microtubules uniformément remplis de polarisation. Organites se déplacent le long de ces processus par des moteurs de microtubules. Facile d'entretien, de sensibilité à la protéine ARNi knock-down et procédure efficace pour créer des lignées cellulaires stables rendre les cellules S2 de drosophile un système modèle idéal pour étudier le transport de marchandises par imagerie en temps réel. Les résultats obtenus avec des cellules S2 peuvent être en outre appliqués à un système plus physiologiquement pertinente: transport axonal dans les neurones primaires en culture à partir d'embryons de Drosophila dissociées. Des neurones en culture se développent de longues neurites remplis de microtubules groupés, très similaires aux processus S2. Comme dans les cellules S2, organelles dans des neurones en culture peuvent être visualisées soit par des colorants fluorescents spécifiques à l'organelle ou en utilisant des marqueurs d'organelles fluorescentes codées par l'ADN injecté dans des embryons précoces ou exprimé dans transgenic vole. Par conséquent, le transport des organites peut être facilement enregistré dans les neurones en culture sur des lamelles de verre en utilisant l'imagerie vivant. Nous décrivons ici les procédures pour la culture et la visualisation de transport de marchandises dans les cellules S2 de drosophile et les neurones primaires. Nous croyons que ces protocoles font deux systèmes accessibles pour les laboratoires qui étudient le transport de fret.

Introduction

Cellules S2 de drosophile ont gagné en popularité de plus en plus pour l'étude de nombreux processus cellulaires. Ces cellules ont été initialement obtenues à partir d'embryons à un stade avancé de trypsinisées OregonR Drosophila melanogaster et maintiennent des caractéristiques de type macrophage 1. Cellules S2 de Drosophila offrent de nombreux avantages par rapport à d'autres lignées cellulaires. Elles sont mises en culture à 25 ° C sans CO 2, et peuvent être visualisés pendant plusieurs heures à la température ambiante sans nécessiter de chauffage ou d'échange de gaz. Plus important encore, les cellules S2 de Drosophila sont très sensibles à un traitement ARNi permet une grande efficacité de knock-down des protéines d'intérêt. Les cellules S2 sont hautement transfectable et des lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés en moins de quatre semaines pour permettre l'expression ectopique stable de protéines d'intérêt. Les cellules S2 poussent normalement soit vaguement attachés mais pas étalés sur un ballon ou en suspension. Ils peuvent être amenés à se propager sur des lamelles prérevêtues avec une conca lectine végétalenavalin A (ConA). La périphérie des cellules de propagation est particulièrement mince et est idéal pour la microscopie de cellules vivantes donc. Des protocoles détaillés pour les cellules S2 de la culture, le traitement ARNi, l'imagerie par immunomarquage direct et la lumière peuvent être trouvés dans la littérature de 2,3. Notre laboratoire a adopté cellules S2 en tant que système modèle pour étudier le transport du fret à base de microtubules. Cellules S2 de Drosophila traités avec un médicament qui dépolymérise ou rompt la F-actine, tels que la cytochalasine D (CytoD), se développent de longs processus remplis de microtubules uniformément polarisées 4 -10, ce qui en fait un système idéal pour étudier le mouvement des marchandises le long des réseaux de microtubules. Différents paramètres de transport dans ces processus (c.-à-trajectoires. Longueurs, vitesses, directivité etc) peuvent être facilement mesurés en utilisant un logiciel de traces de particules automatisé, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Ces propriétés rendent les cellules S2 un système attrayant pour étudier le transport de cargaison le long des microtubules dans les cellules de culture de tissu.

Des expériences pilotes dans les cellules S2 peuvent être étendus à un modèle physiologique important des études de transport de marchandises dans la drosophile neurones primaires. Similaire à des cellules S2, les neurones mis en culture à partir d'embryons dissociées sont perméables aux petites molécules telles que des colorants et des inhibiteurs, et l'imagerie haute résolution en temps réel du transport des organites peuvent être effectuées dans des neurones à la température ambiante. En utilisant la drosophile fonds génétiques différents, nous pouvons examiner la fonction des gènes dans les neurones primaires par KO (mutations génétiques perte de fonction), knockdown (injection d'ARNdb ou expression) ou l'expression ectopique (mouches transgéniques). Plus précisément, la fragmentation des filaments d'actine en utilisant le traitement CytoD n'empêche pas la croissance des neurites, mais plutôt qu'ils poussent plus vite, et ainsi nous pouvons étudier microtubules dependent le transport des organites dans les neurones CytoD traités sans l'influence de filaments d'actine 11. Par conséquent, les cultures primaires de neurones combinent les avantages des cellules de culture de tissus et de voler la génétique, ce qui en fait un excellent système pour étudier le transport de fret dans un système pertinent physiologique 10,12. Depuis plusieurs maladies neurodégénératives familiales pourraient être causés par ou associées à des défauts de transport de marchandises (par exemple de la maladie de Parkinson 13, la maladie de Huntington 14, la maladie d'Alzheimer 15,16, la sclérose latérale amyotrophique / ALS 17, HMN7B et Perry syndrome 18,19, et Ataxie spinocérébelleuse type 5/SCA5 20), les cultures primaires de neurones peuvent être utiles dans l'analyse des effets de mutations spécifiques qui causent ces maladies sur le transport des microtubules dépendant.

Enfin, les propriétés importantes de transport des microtubules dépendant sont bien conservées entre les mammifères et les mouches, mais Culture génétique et cellulaire chez la drosophile est moins cher et prend du temps, ce qui justifie l'utilisation de cellules de drosophile en culture pour l'étude des aspects essentiels de transport des organites dans des conditions normales et pathologiques.

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Protocole

Une. Cellules S2 de Drosophila

  1. Préparation des lamelles couvre-objet enduites ConA

    1. Placez les lamelles dans un rack en céramique et les laver par immersion de l'acide chromique pendant 1 heure. [ATTENTION: l'acide chromique est corrosif et peut provoquer une irritation des yeux, du nez, de la gorge et de la peau].
    2. Rincer abondamment avec de lamelles constamment courir dH 2 O pendant 30 minutes jusqu'à ce que l'acide est complètement délavé.
    3. Laissez l'air lamelles sec et les enrober de ConA (solution à 0,5 mg / ml dans dH 2 O) pendant 30 min.
    4. Rincer lamelles avec dH 2 O pendant 15 minutes et laisser sécher à l'air. Lamelles recouvertes ConA peuvent être stockés jusqu'à 1 mois.

  2. Étalement des cellules

    1. Laisser les cellules S2 de croître de façon exponentielle en T25 ou T75 cm2 en fonction du nombre de cellules nécessaires pour l'expérience.
    2. Compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Ajouter une croissance ml moyenne (par exemple les insectes Xpress) dans une boîte de 35 mm de tissu de culture avec de la ConA lamelle revêtue, et le transfert en douceur ~ 1 x 10 5 cellules à l'antenne. Cette densité cellulaire est optimale pour l'imagerie parce que les procédés à partir de cellules différentes ne se chevauchent pas.
    3. Afin d'induire la formation de processus, immédiatement après l'étalement ajouter 1 ml de milieu avec 5 uM CytoD à l'antenne (à la concentration finale de 2,5 uM CytoD). Permettre le plein développement de procédés en incubant les cellules au moins pendant 2 heures à 25 ° C avant l'imagerie.

2. Drosophila primaire Neuron Culture

  1. Préparation pour la culture de neurones

    1. Préparer Drosophila milieu de croissance neuronale (milieu de Schneider supplémenté avec 20% de sérum de fœtus bovin, inactivé par la chaleur à 55 ° C pendant 30 min, 5 ug / ml d'insuline, 100 ug / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 10 pg / ml de tetracycline) . Ce soutienle milieu de plemented Schneider peut être conservé à 4 ° C pendant 6 mois.
    2. Préparer la pomme flacons de gélose au jus de collecte de Drosophila embryons (22,5 g d'agar-agar, 12,0 g de saccharose et 750 ml H 2 O dans un ballon de 2 litres, autoclave pendant 20 à 25 min, ajouter 250 ml de jus de pomme et verser ~ 10 ml dans chaque Drosophila flacon, après solidification, branchez flacons avec des boules de coton, et l'envelopper d'une pellicule de flacons en plastique pour aliments afin d'éviter un séchage excessif de la nourriture). Le jus de pomme dans des flacons de gélose peut être conservé à 4 ° C dans des sacs en plastique bien fermés pendant 4 semaines.
    3. Lavés à l'acide manteau 25 mm lamelles de cercle avec ConA (voir détails dans le protocole pour les cellules S2 de drosophile) et stériliser les sous lumière UV pendant 10-15 min. Ces lamelles peuvent être stockés pendant un mois.

  2. Culture des neurones embryonnaires de Drosophila

    1. Gardez jeune adulte vole dans des flacons de gélose pomme de jus additionné de levure sèche de 1-2 jours avant la collecte des embryons fou la préparation de neurones.
    2. Le jour de collecte, afin de synchroniser les embryons collectés, transfert mouches adultes à une pomme jus agar flacon pendant 1 heure précollecte à la lumière et jeter ces embryons.
    3. Transfert vole vers un nouveau flacon de jus de gélose de pomme, de recueillir des embryons pendant 1 heure, et de transférer les mouches à un autre flacon pendant une heure, à la fois dans l'obscurité pour augmenter le rendement de l'embryon.
    4. Retirez les mouches adultes à partir du jus de pomme agar flacon et laisser les embryons se développent encore 4 h à étapes 9-11 à la température ambiante (4-6 embryons h-vieux sont entre le stade 9-11).
    5. Retirez les embryons en injectant de l'eau dans des flacons et desserrant les embryons du jus de pomme agar avec un petit pinceau (au moins 10 embryons sont nécessaires pour une bonne préparation des neurones).
    6. Transférer les embryons à un filet de nylon tamis cellulaire 100 um avec une pipette de transfert pour évacuer l'eau (prélavage la pipette de transfert chez la drosophile tampon de lavage de l'embryon, 0,4% de NaCl, 0,03% de TritonX-100).
    7. Recueillir les embryons de la crépine en utilisant un petit pinceau, et les transférer dans un microtube de 1,5 ml remplie de 1 ml Drosophila lavage de l'embryon (Note: nettoyer les fibres de gélose ou de coton à l'aide du pinceau ou des embouts de pipette). Dans ce protocole, le microtube de 1,5 ml est livré avec une pastille jetable pilon correspondant.
    8. Laver les embryons dans l'embryon de drosophile lavage 3x.
    9. Dechorionate les embryons dans une solution d'eau de Javel frais 01h01 commerciale et 95% d'éthanol pour 10 min [ATTENTION: l'eau de Javel peut provoquer une irritation des yeux, du nez, de la gorge et de la peau].
    10. Passez à la hotte de culture de tissus, et laver les embryons 2x en milieu de Schneider complété.
    11. Laissez 200-300 milieu de pi dans le tube avec les embryons, et doucement dissocier mécaniquement embryons dechorionated utilisant Kimble Chase pilons de granulés jetables qui ont été stérilisées par 70% d'éthanol (10-15x moudre).
    12. Centrifuger le mélange homogénéisé à 20 g pendant 2 min, et transfer le surnageant dans un tube frais. [Cette étape est facultative, elle aide à éliminer les débris de l'embryon]
    13. Centrifuger le surnageant à 550 x g pendant 2 min pour sédimenter les cellules.
    14. Reprendre le culot dans 500 ul de cellules de moyennes et de spin de Schneider complété à nouveau à 550 g pendant 2 min; répéter le cycle de remise en suspension de filage fois.
    15. Enfin remettre en suspension le culot dans 100 pl ~ supplémenté le milieu de Schneider et de la plaque les cellules sur une lamelle couvre-objet de 25 mm revêtu de ConA dans une boîte de Pétri de 35 mm stériles. Incuber pendant 10 min pour permettre la fixation des cellules.
    16. Ajouter 2 ml de milieu de Schneider, complétée avec 5 uM CytoD pour submerger la lamelle avec des cellules attachées.
    17. Incuber le plat dans une humidifié 25 ° C incubateur pendant une nuit avant l'imagerie.

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Résultats

Cellules S2 de drosophile attachés sur la propagation de la lamelle ConA revêtu dans un plat rond de forme de "crêpe" (Figures 1A et 1C). Cependant, lorsque les cellules étalées sur des lamelles couvre-S2, en présence d'CytoD et autorisés à se propager pendant 2-3 heures, ils forment de longs processus minces remplis par les microtubules parallèles (figures 1B et 1D). Ces microtubules ont une polarité uniforme avec plus-se termine sur 7.

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Discussion

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour étudier le transport de fret microtubules dépendante dans les cellules S2 de drosophile et de la culture de neurones primaires. Les processus et les neurites S2 sont des structures remplies par groupés microtubules tableaux qui servent de pistes pour le transport des organites.

Deux stratégies sont généralement utilisées pour des organelles de l'étiquette: la transfection de vecteurs codant pour une protéine fluorescente ayant un...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Gelfand qui ont contribué à l'élaboration de ces protocoles. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national de sciences générales médical des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution R01GM052111 de VIG et par basque ministère du gouvernement de l'Éducation, des Universités et de la Recherche sous le numéro d'attribution BFI-2011-295 à UdC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poudre Milieu cellulaire d’insecte (Schneider' s)SigmaS9895
Insecte &ndash ; Xpress mediumFisherBW12730Q
InsulineSigmaI6634
PénicillineResearch Products InternationalP93000
StreptomycineResearch Products InternationalS62000
Chlorhydrate de tétracyclineSigmaT7660-5G
Sérum fœtal bovinAtlanta BiologicalsS11150
Concanavalin ASigmaC2010
Cytochalasine DVWRIC15077105
LysoTracker Rouge DND-99Sondes moléculairesL7528
100 µ ; m Crépine à cellulesFisher Scientific22363549
25 mm Verre de couverture circulaireVWR48380 080
Drosophila Flacons VWR89092-730
Pilons à granulés jetables avec microtubesassortis Kimble Chase749520-0000

Références

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