Fjernbetjening Magnetic Aktivering af Mikrometerjustering Probes for<em> In situ</em> 3D Kortlægning af bakteriebiofilm Fysiske egenskaber

Summary

Dette papir viser en original metode baseret på fjernbetjeningen aktivering af magnetiske partikler seedede i en bakteriel biofilm og udvikling af dedikerede magnetiske pincet til at måle in situ den lokale mekaniske egenskaber af den komplekse levende materiale bygget af mikroorganismer på grænseflader.

Abstract

Bakteriel adhæsion og vækst på grænseflader føre til dannelse af tredimensionale heterogene strukturer såkaldte biofilm. Cellerne bolig i disse strukturer er holdt sammen af ​​fysiske interaktioner medieret af et netværk af ekstracellulære polymere stoffer. Bakterielle biofilm påvirke mange menneskelige aktiviteter og forståelsen af ​​deres egenskaber er afgørende for en bedre styring af deres udvikling – vedligeholdelse eller udryddelse – afhængig af deres skadelig eller gavnlig resultat. Dette papir beskriver en roman metode tager sigte på at måle in situ den lokale fysiske egenskaber af biofilm, der havde været, indtil nu, alene undersøges fra en makroskopisk og homogent materiale perspektiv. Den her beskrevne eksperiment involverer indførelse af magnetiske partikler i en voksende biofilm frø lokale prober, der kan fjernstyres aktiveres uden at forstyrre de strukturelle egenskaber af biofilmen. Dedikerede magnetiske pincet var developed at udøve en defineret kraft på hver partikel indlejret i biofilmen. Opsætningen er monteret på scenen af ​​et mikroskop for at muliggøre registrering af time-lapse billeder af partikel-trækker periode. De partikelbaner ekstraheres derefter fra trække sekvens og de lokale viskoelastiske parametre afledt fra hver forskydningskurve partikel, hvorved der tilvejebringes 3D-rumlige fordeling af parametre. Opsamling indsigt i biofilmen mekanisk profil er afgørende fra en ingeniør synspunkt for biofilm kontrolformål, men også ud fra et grundlæggende perspektiv for at afklare forholdet mellem de arkitektoniske egenskaber og den specifikke biologi af disse strukturer.

Introduction

Bakterielle biofilm er fællesskaber af bakterier forbundet med biologiske eller kunstige overflader ^1-3. De udgør med en vedhæftning vækst mekanisme kombineret med produktionen af polysaccharid-rige ekstracellulære matrix, der beskytter og stabiliserer bygningsværk ^4,5. Disse biofilm er ikke blot passive samlinger af celler fast på overflader, men organiseret og dynamiske komplekse biologiske systemer. Når bakterierne skifter fra planktoniske til biofilm livsstil, er ændringer i genekspression og celle fysiologi observeret samt øget antibiotikaresistens og vært immunforsvar bliver på oprindelsen af mange vedvarende og kroniske infektioner ^6. Men kontrolleret udvikling af disse levende strukturer også tilbyde, muligheder for industrielle og miljømæssige applikationer, såsom bioremediering af farligt affald sites, bio-filtrering af industriel vand eller dannelse af bio-barrierer for at beskytte jord og grundvand fra contamination.

Mens molekylære karakteristika for biofilm livsstil i stigende grad beskrives de mekanismer, der driver udvikling af lokalsamfundet og vedholdenhed fortsat uklare. Brug de seneste fremskridt på mikroskala målinger ved hjælp scanning elektrokemisk eller fluorescens mikroskopi, har disse levende organisationer er blevet vist at udvise en betydelig strukturel, kemiske og biologiske heterogenitet ^7. Men indtil nu, biofilm mekanik er hovedsagelig blevet undersøgt makroskopisk. For eksempel observation af biofilm streamers deformation som følge af variationer i fluidstrømningshastigheder ^8,9 énakset komprimering af biofilm stykker løfter fra agar medium eller dyrkes på låget glider ^10,11, forskydning af biofilm indsamlet fra miljøet og derefter overført til en parallel plade rheometer ^12,13, atomic force spektroskopi ved hjælp af en glasperle og belagt med en bakteriel biofilm knyttet til en AFM cantilever ¹⁴ eller en dedikeret MICRocantilever metode til at måle trækstyrke løsrevne biofilm fragmenter ^15,16 er blevet gennemført i løbet af de sidste ti år, hvilket giver nyttige oplysninger om viskoelastiske af materialets art ^17. Men det lader til, sandsynligt, at oplysninger om in situ biofilm mekaniske egenskaber går tabt, når materialet er fjernet fra dets oprindelige miljø, som ofte var tilfældet i disse tilgange. Desuden behandling af biofilm som et homogent materiale misser oplysninger om mulige heterogenitet de fysiske egenskaber i samfundet. Derfor kan de nøjagtige konsekvenser af strukturen mekanik i biofilmdannelse og biologiske egenskaber såsom genekspression mønster eller kemiske gradienter næppe blive anerkendt. For at gøre fremskridt i retning af en mikroskala beskrivelse af biofilm fysiske egenskaber, er nye dedikerede værktøj.

Dette papir beskriver en original tilgang udtænkt til at opnåmåling af lokale mekaniske parametre in situ uden at forstyrre biofilmen og muliggør tegning af den rumlige fordeling af de mikroskala materialeegenskaber og derefter den mekaniske heterogenitet. Princippet i forsøget hviler på doping af en voksende biofilm med magnetiske mikropartikler efterfulgt af deres afsides pålæsning med magnetiske pincet i den modne biofilm. Partikel forskydning under kontrolleret magnetisk kraftpåvirkning afbildet under mikroskop muliggør lokal viskoelastiske parameter afledning, hver partikel rapporterer sin egen lokale miljø. Ud fra disse data kan 3D mekaniske profil biofilmen drages, afslørende rumlige og miljømæssig stand afhængigheder. Hele eksperimentet vil blive vist her på en E. coli biofilm fra en gensplejset stamme, som bærer en derepresseres F-lignende plasmid. Resultaterne er beskrevet i et nyligt papir ¹⁸ giver en unik vision af det indre af intakte biofilm mekanik.

Protocol

1.. Bakterier Kultur og Suspension Forberedelse Vælg en friskdyrket koloni fra en lysogeni Broth (LB) agarplade inokuleres det i 5 ml flydende LB-medium indeholdende 100 μ g / ml ampicillin og 7,5 μ g / ml tetracyklin og inkubere det i 5 til 6 timer ved 37 ° C på et rystebord. Derefter tilsættes 100 μ l af bakteriekulturen i 5 ml minimalmedium (M63B1) suppleret med 0,4% glucose og de ​​samme koncentrationer af antibiotikum. Inkuber denne frisk fortyndede kultur …

Representative Results

En typisk analyse vil give den rumlige fordeling af viskoelastiske parametre på micron skala på en levende biofilm uden at forstyrre dens originale arrangement. Typiske resultater er vist i figur 7, hvor værdierne af J 0 – den elastiske opfyldelse – er givet som en funktion af z-aksen langs dybden og på y-aksen langs en ​​lateral dimension af biofilmen. Hvert punkt svarer til en kugle, som krybe kurve analyse har givet en J 0 værdi. De data viste, at den lokale overholdels…

Discussion

Denne magnetisk partikel såning og trække eksperiment aktiveret in situ 3D kortlægning af viskoelastiske parametre for en voksende biofilm i sin oprindelige tilstand. Denne fremgangsmåde viste mekaniske heterogenitet af E. coli biofilm dyrkes her og gav spor at påpege de biofilm komponenter understøtter de biofilm fysiske egenskaber, hvilket kraftigt antyder en grundlæggende konsekvens af den ekstracellulære matrix og mere præcist dens grad af krydsbinding.

Anerken…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin