Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor<em> In situ</em> 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen

Summary

Dit document toont een originele methode gebaseerd op de afstandsbedieningsinrichting van magnetische deeltjes geënt in een bacteriële biofilm en de ontwikkeling van specifieke magnetische pincet meten in situ lokale mechanische eigenschappen van het complex levend materiaal gebouwd door micro-organismen aan grensvlakken.

Abstract

Bacteriële hechting en groei interfaces tot de vorming van driedimensionale structuren heterogeen zogenaamde biofilms. De cellen woning in deze structuren worden samengehouden door fysische interacties gemedieerd door een netwerk van extracellulaire polymere stoffen. Bacteriële biofilms beïnvloeden vele menselijke activiteiten en het begrip van hun eigenschappen is cruciaal voor een betere controle van hun ontwikkeling – onderhoud of uitroeiing – afhankelijk van hun ongunstig, hetzij gunstig resultaat. Dit document beschrijft een nieuwe methode gericht op het meten in situ lokale fysische eigenschappen van de biofilm die was tot nu uitsluitend getoetst op een macroscopisch homogeen materiaal perspectief. De hier beschreven experiment omvat de invoering van magnetische deeltjes in een groeiende biofilm aan lokale sondes die op afstand worden bediend kan zonder verstoring van de structurele eigenschappen van de biofilm zaad. Dedicated magnetische pincet waren devekeld om een ​​bepaalde kracht uit te oefenen op elk deeltje ingebed in de biofilm. De setup is gemonteerd op het podium van een microscoop om de opname van time-lapse beelden van de deeltjes trekken kunnen ontstaan. De deeltjestrajecten wordt geëxtraheerd uit het trekken sequentie en de lokale visco-elastische parameters afgeleid uit elk deeltje verplaatsing curve, waardoor de 3D-ruimtelijke verdeling van de parameters. Het verkrijgen van inzicht in de biofilm mechanische profiel is van essentieel belang vanuit het oogpunt van een ingenieur van mening voor biofilm controle doeleinden, maar ook vanuit een fundamenteel perspectief op de relatie tussen de architectonische eigenschappen en de specifieke biologie van deze structuren te verduidelijken.

Introduction

Bacteriële biofilms zijn gemeenschappen van bacteriën in verband met biologische of kunstmatige oppervlakken ^1-3. Ze vormen van een adhesie-groeimechanisme gekoppeld aan de productie van polysaccharide-rijke extracellulaire matrix die het bouwwerk ^4,5 beschermt en stabiliseert. Deze biofilms zijn niet alleen passief assemblages van cellen vast aan oppervlakken, maar georganiseerd en dynamische complexe biologische systemen. Wanneer bacteriën schakelen van plankton tot biofilm levensstijl, worden veranderingen in genexpressie en cel fysiologie en waargenomen als een stijging antibioticaresistentie en gastheer immuunsysteem aan de oorsprong van vele hardnekkige en chronische infecties ^6. Echter, de gecontroleerde ontwikkeling van deze levende structuren bieden ook kansen voor de industrie en milieu-toepassingen, zoals het saneren van locaties met gevaarlijk afval, bio-filtratie van industrieel water of vorming van bio-belemmeringen voor de bodem en het grondwater te beschermen tegen Contaminatie.

Terwijl de moleculaire kenmerken die specifiek zijn voor biofilm manier van leven in toenemende mate worden beschreven, de mechanismen achter de ontwikkeling van de gemeenschap en doorzettingsvermogen blijven onduidelijk. De recente ontwikkelingen op microschaal metingen met scanning elektrochemische of fluorescentiemicroscopie hebben deze levende organisaties is aangetoond dat aanzienlijke structurele, chemische en biologische heterogeniteit ^7. Maar, tot nu toe, biofilm monteurs zijn vooral macroscopisch onderzocht. Zo waarneming van biofilm streamers vervorming als gevolg van variaties in fluïdumstroomsnelheden ^8,9, uniaxiale druk van biofilm stukken heffen van agar medium of gegroeid op hoes schuift ^10,11, dwarskracht biofilm vanuit het milieu en vervolgens overgebracht naar een parallelle plaat reometer ^12,13, atomic force-spectroscopie met een glazen kraal en gecoat met een bacteriële biofilm bevestigd aan een AFM cantilever ¹⁴ of een speciale MICRocantilever methode voor het meten van de treksterkte van vrijstaande biofilm fragmenten ^15,16 zijn uitgevoerd gedurende de laatste tien jaar, het verstrekken van nuttige informatie over de visco-elastische aard van het materiaal ^17. Toch lijkt het waarschijnlijk dat gegevens over in situ biofilm mechanische eigenschappen verloren wanneer het materiaal wordt verwijderd uit zijn natuurlijke omgeving, die vaak in deze benaderingen was. Bovendien is de behandeling van de biofilm als een homogeen materiaal mist de gegevens over de mogelijke heterogeniteit van de fysische eigenschappen binnen de gemeenschap. Daarom is de exacte implicaties van de structuur mechaniek in de biofilmvorming en biologische eigenschappen, zoals genexpressie patroon of chemische gradiënten nauwelijks worden herkend. De overgang naar een microschaal beschrijving van de biofilm fysische eigenschappen, zijn nieuwe speciale gereedschappen nodig.

Deze paper Gegevens een originele aanpak bedacht te bereikenmeting van lokale mechanische parameters in situ zonder de biofilm en waardoor tekening van de ruimtelijke verdeling van de microschaal materiaaleigenschappen en de mechanische heterogeniteit. Het principe van het experiment berust op de dotering van een groeiende biofilm met magnetische microdeeltjes gevolgd door hun afgelegen inladen met magnetische pincet in het rijpe biofilm. Deeltje verplaatsing onder gecontroleerde magnetische kracht toepassing afgebeeld onder de microscoop stelt lokale visco-elastische parameter afleiding, elk deeltje de rapportering van haar eigen lokale omgeving. Uit deze gegevens kan de 3D-mechanische profiel van de biofilm worden getrokken, onthullende ruimtelijke en milieuconditie afhankelijkheden. De hele experiment wordt hier getoond een E. coli biofilm die door een genetisch gemanipuleerde stam die een gederepresseerde F-achtige plasmide. De beschreven in een recent artikel ¹⁸ resultaten geven een unieke visie op het interieur van intacte biofilm mechanica.

Protocol

1. Bacteriën Cultuur en Suspension Voorbereiding Kies een vers gekweekte kolonie uit lysogenie Broth (LB) agar plaat, inoculeren in 5 ml vloeibaar LB-medium dat 100 μ g / ml ampicilline en 7,5 μ g / ml tetracycline en incubeer voor 5 tot 6 uur bij 37 ° C op een trillende platform. Voeg vervolgens 100 μ l van de bacteriecultuur in 5 ml minimaal medium (M63B1) aangevuld met 0,4% glucose en hetzelfde antibioticum concentraties. Incubeer dit vers verdund cultuur overnacht…

Representative Results

Een typische analyse zal de ruimtelijke verdeling van de visco-elastische parameters te leveren tegen de micron schaal op een levend biofilm zonder zijn oorspronkelijke schikking te verstoren. Typische resultaten worden getoond in figuur 7 waarin de waarden J 0 – de elastische uitvoering – gegeven als functie van de z-as langs de diepte en de y-as langs een dwarsafmeting van de biofilm. Elk punt komt overeen met een kraal die kruip curve analyse heeft gegeven van een J 0 waarde. De…

Discussion

Deze magnetische deeltjes zaaien en trekken experiment geactiveerd in situ 3D-kaarten van de visco-elastische parameters van een groeiende biofilm in de oorspronkelijke staat. Deze benadering bleek de mechanische heterogeniteit van de E. coli biofilm hier gegroeid en gaf aanwijzingen te wijzen op de biofilm componenten ondersteunen van de biofilm fysische eigenschappen, sterk suggereert een fundamentele implicatie van de extracellulaire matrix en meer bepaald de mate van cross-linking.

<p class="jo…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin