מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.
הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם – תחזוקה או חיסול – תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.
biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים 1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה 4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים 6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון bioremediation של אתרי פסולת מסוכנים, ביו סינון של מים או היווצרות של ביו מחסומים כדי להגן על קרקע ומי תהום מcontamin תעשייתייםation.
בעוד תכונות מולקולריות ספציפיות לדרך biofilm החיים מתוארות יותר ויותר, את המנגנונים המניעים את התפתחות הקהילה והתמדה עדיין אינם ברורים. שימוש בהתקדמות שחלה באחרונה במדידות microscale באמצעות אלקטרוכימיים סריקה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ארגוני חיים אלה הוכחו תערוכה ניכרת מבני, כימי וביולוגית ההטרוגניות 7. עם זאת, עד עכשיו, מכניקת biofilm נבדק בעיקר macroscopically. למשל, התבוננות בסרטי biofilm עיוות עקב שינויים בשיעורי זרימת נוזל 8,9, דחיסת uniaxial של חתיכות biofilm להרים ממדיום אגר או גדלה על הכיסוי מחליק 10,11, גזירה של biofilm שנאסף מהסביבה ולאחר מכן הועבר למקביל rheometer צלחת 12,13, ספקטרוסקופיה כוח אטומי באמצעות חרוז זכוכית ומצופה עם biofilm חיידקים מצורפים AFM שלוחה 14 או MICR ייעודישיטת ocantilever למדידת חוזק המתיחה של שברי biofilm מנותקים 15,16 יושמו במהלך עשר השנים האחרונות, ומספקת מידע שימושי על טבע viscoelastic של החומר 17. עם זאת, סביר להניח שמידע על תכונות מכאניות biofilm אתרו הולך לאיבוד כאשר החומר מוסר מהסביבה המקורית שלו, שהייתה קורים לעתים קרובות בגישות אלה. יתר על כן, הטיפול של biofilm כחומר הומוגני מחמיץ את המידע על ההטרוגניות האפשרית של התכונות פיזיות בקהילה. לכן, ההשלכות של מכניקת המבנה בהיווצרות biofilm ותכונות ביולוגיות כגון דפוסים ביטוי גנים או הדרגתיים כימי המדויקות בקושי יכולות להיות מוכרות. כדי להתקדם לכיוון תיאור microscale של התכונות פיזיות biofilm, כלים ייעודיים חדשים נדרשים.
מאמר זה מפרט את הגישה מקורית יזום כדי להשיגמדידה של פרמטרים מקומיים מכאניים באתר, מבלי להפריע את biofilm ומאפשר ציור של הפריסה המרחבית של תכונות חומר microscale ולאחר מכן ההטרוגניות מכאנית. העיקרון של הניסוי נשען על הסימום של biofilm גדל עם microparticles המגנטי ואחרי הטעינה מרחוק שלהם באמצעות פינצטה מגנטית בbiofilm הבוגר. עקירת חלקיקים תחת יישום כוח מגנטי מבוקר צילם מתחת למיקרוסקופ מאפשרת גזירת פרמטר viscoelastic מקומית, כל חלקיק דיווח הסביבה המקומית משלה. מתוך נתונים אלה, הפרופיל המכני 3D של biofilm ניתן להסיק, חושף dependences מצב מרחבית וסביבתי. כל הניסוי תוכלו לראות כאן על E. biofilm coli שנעשה על ידי זן מהונדס גנטי נושא פלסמיד כמו F-derepressed. התוצאות מפורטות במאמר האחרון 18 מספקות חזון ייחודי של הפנים של מכניקת biofilm ללא פגע.
חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיס?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו הייתה חלק נתמך על ידי מענקים מNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, תכנית PIRIbio Dynabiofilm ומתכנית סיכוני הבינתחומי CNRS. אנו מודים לפיליפ Thomen לקריאה הביקורתית של כתב היד וכריסטוף Beloin למתן א זן חיידק המשמש בעבודה זו.
Table 1: Reagents and cells | ||||
Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter | |
Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | ||
Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | ||
Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline | ||
Table 2: Capillaries and tubing | ||||
Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | ||
Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3mm | |
Table 3: Biofilm growth | ||||
Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | standard medium used to grow bacteria | |
M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria | ||
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose | |
Table 4: Electronics | ||||
Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | ||
Heater controller | World precision instruments | 300354 | ||
Function generator | Agilent technologies | 33210A | ||
Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | ||
Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | ||
Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | ||
Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | ||
Table 5: Optics | ||||
Inverted microscope | Nikon | TE-300 | ||
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth | ||
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. | |
Table 6: Image analysis | ||||
ImageJ | NIH – particle tracker plugin |