Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для<em> На месте</em> 3D Mapping бактериальных биопленок физических свойств

Summary

В данной работе показано оригинальную методологию, основанную на пульте дистанционного приведения в действие магнитных частиц, посеянных в бактериальной биопленки и развитие специализированных магнитных пинцетом для измерения на месте местные механические свойства комплексной жилой материала построен микроорганизмов на границах.

Abstract

Бактериальной адгезии и роста на интерфейсах привести к образованию трехмерных гетерогенных структур так называемых биопленки. Клетки, живущие в этих структурах скрепляются физических взаимодействий, опосредованных сети внеклеточных полимерных веществ. Бактериальные биопленки влиять на многие виды деятельности человека и понимание их свойств имеет решающее значение для лучшего контроля их развития – сохранение или ликвидация – в зависимости от их отрицательное или положительное исходом. Эта статья описывает новую методологию, направленную для измерения на месте местные физические свойства биопленки, которая была, до сих пор рассматривалось только от макроскопического и однородного материального точки зрения. Эксперимент, описанный здесь включает введение магнитных частиц в растущую биопленки, чтобы отобрать местные зондов, которые могут быть дистанционным управлением, не нарушая структурные свойства биопленки. Выделенные магнитные пинцет были развивприпрыжку приложить определенное усилие на каждой частице, встроенного в биопленки. Установка монтируется на этапе микроскопом, чтобы включить запись покадровой изображений на период частиц потянув. Траектории частиц затем извлекают из тянущего последовательности и местные вязкоэластичные параметры выводятся из каждой кривой частиц смещения, тем самым обеспечивая 3D-пространственное распределение параметров. Получение взглянуть на биопленки механической профиль имеет важное значение с точки инженера зрения для целей контроля биопленки, но и с фундаментальной точки зрения, чтобы уточнить связь между архитектурными свойствами и конкретного биологии этих структур.

Introduction

Бактериальные биопленки сообщества бактерий, связанных с биологическими или искусственных поверхностей ^1-3. Они образуют с помощью механизма адгезии роста в сочетании с производством полисахарида богатых внеклеточного матрикса, который защищает и стабилизирует здание ^4,5. Эти биопленки не просто пассивные комплексы клеток, застрявших на поверхности, но организовал и динамические сложные биологические системы. Когда бактерии переключаться с планктонных в биопленки образа жизни, изменения в экспрессии генов и клеточной физиологии наблюдаются, а также повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам и провести иммунную защиту будучи в начале многих стойких и хронических инфекций ^6. Тем не менее, под контролем развитие этих живых структур также предлагают возможности для промышленных и экологических применений, таких как биоремедиации мест захоронения опасных отходов, био-фильтрации технической воды или образования био-барьеров для защиты почвы и грунтовых вод от разлиAtion.

В то время как молекулярные особенности, характерные для биопленки образа жизни все чаще описываются механизмы, способствующие развитию развитию общин и упорство остаются неясными. Используя последние достижения на микромасштабных измерений с использованием сканирования электрохимические или флуоресцентной микроскопии, эти живые организации было показано, обладает значительным структурным, химической и биологической гетерогенности ^7. Тем не менее, до сих пор, механика биопленки не были в основном рассмотрены макроскопически. Например, наблюдение биопленки стримеров деформации из-за различий в жидкости расхода ^8,9, одноосное сжатие биопленки штук поднять из агаровой среде или выращивают на покрытие скользит ^10,11, сдвиг биопленки, собранной из окружающей среды, а затем перевели в параллельный пластина Реометр ^12,13, атомно-силовая спектроскопия с использованием бусины и покрытием с бактериальной биопленки, прикрепленной к АСМ кантилевера ¹⁴ или выделенной микрocantilever метод измерения прочности на разрыв отдельные фрагменты биопленки ^15,16 были реализованы в течение десяти последних лет, предоставляя полезную информацию о вязкоупругой природы материала ^17. Тем не менее, вполне вероятно, что информация о в точке биопленки механических свойств теряется, когда материал будет удален из его родной среде, которая была часто бывает в этих подходов. Кроме того, лечение биопленки в виде однородного материала попадает в информацию о возможном неоднородности физических свойств в обществе. Таким образом, точные последствия механике структуры в формировании биопленок и биологических черт, таких как экспрессии генов паттерна или химических градиентов вряд ли могут быть признаны. Для продвижения к микромасштабной описания биопленки физических свойств, новые специализированные инструменты необходимы.

Эта статья подробно оригинальный подход задуман для достиженияизмерение локальных механических параметров в месте, не нарушая биопленки и позволяет чертеж пространственного распределения микромасштабных свойств материала, а затем механической неоднородности. Принцип эксперимента опирается на легирования растущей биопленки с магнитными микрочастицами с последующим их удаленной загрузки с использованием магнитных пинцетом в зрелом биопленки. Смещение частиц при контролируемой магнитной силовой применения отображаемого под микроскопом позволяет местным вывод параметров вязкоупругих, каждую частицу отчетности собственную локальную среду. Исходя из этих данных, 3D механический профиль биопленки можно сделать, открыв пространственных и экологических условий зависимости. Весь эксперимент будет показано здесь на Е. палочка биопленки сделаны генной инженерии штамм, несущий derepressed F-как плазмиды. Результаты подробно изложены в недавней работе ¹⁸ обеспечивают уникальное видение интерьера интактных механики биопленки.

Protocol

1. Бактерии Культура и подготовка Подвеска Выберите только что выращенного колонию из чашки с агаром лизогении бульон (LB), привить его в 5 мл жидкость LB среду, содержащую 100 μ г / мл ампициллина и 7,5 μ г / мл тетрациклина и инкубировать в течение 5 до 6 часов при 37 ° С на встряхив…

Representative Results

Типичный анализ даст пространственное распределение вязкоупругих параметров на микрон шкалой на живого биопленки, не нарушая его оригинальное расположение. Типичные результаты приведены на рисунке 7, где значения J 0 – упругой податливости, – приводятся в зависимости от …

Discussion

Это магнитная частица посева и потянув эксперимент включен на месте 3D отображения вязкоупругих параметров растущего биопленки в исходное состояние. Этот подход показал механическую неоднородность Е. палочка биопленки вырос здесь и дал ключи, чтобы указать на компоненты био…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin