Metoder for å studere virkningsmekanismer av antipsykotiske legemidler i<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Tilnærminger for å teste effekten av antipsykotiske medikamenter (APDS) i Caenorhabditis elegans blir demonstrert. Analysene er beskrevet for å teste narkotika effekter på utvikling og levedyktighet og på pharyngeal pumping rate. Disse metodene er også aktuelt for farmakogenetiske eksperimenter med narkotika andre enn APDS klasser.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en enkel genetisk organisme mottagelig for storskala forover og bakover genetiske skjermer og kjemiske genetiske skjermer. The C. elegans genomet inneholder potensiell antipsykotisk medikament (APD) mål bevares hos mennesker, inkludert gener som koder for proteiner som er nødvendige for nevrotransmitter-syntese og for synaptisk struktur og funksjon. APD eksponering gir forsinket utvikling og / eller letalitet i nematoder på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse fenotypene er forårsaket delvis av APD-indusert hemming av svelg-pumping 1,2. Dermed har utviklings fenotype en nevromuskulær basis, noe som gjør det nyttig for farmakogenetiske studier av nevroleptika. Her viser vi detaljerte prosedyrer for testing APD effekter på nematode utvikling og svelg-pumping. For utviklings analysen, er synkronisert embryoer plassert på nematode vekstmedium (NGM) plater som inneholder APDS, og stadier av utviklingen av animals blir deretter scoret daglig. For svelg pumpehastigheten analysen, iscenesatt unge voksne dyr er testet på NGM plater som inneholder APDS. Antallet svelg pumper per tidsenhet er spilt inn, og pumpehastighet beregnes. Disse analyser kan anvendes for å studere mange andre typer av små molekyler eller til og med store molekyler.
Introduction
Caenorhabditis elegans er en enkel genetisk organisme mottagelig for store forover og bakover genetiske skjermer og kjemiske genetiske skjermer. C. elegans er følsom for et bredt spekter av biologisk aktive forbindelser, og har derfor vært brukt med hell for å definere de virkningsmekanismer av en rekke slike forbindelser. For eksempel, bioaktive forbindelser studert ved hjelp av ormen Farmakogenetikk inkluderer acetylkolin reseptor agonister (f.eks levamisole, nikotin, morantel, og pyrantel), anestetika (f.eks halotan), koffein, kolinesterasehemmere (f.eks aldicarb, lannate, og triklorfon), fluor, GABA-relaterte forbindelser (f.eks GABA og muscimol), Ivermectin, paraquat, forbolestere, og serotonin-relaterte medikamenter (f.eks serotonin og imiprimine) tre. Videre C. elegans har vært brukt i stor skala lite molekyl skjermer, slik at oppdagelsen av nye bioaktive stoffets og identifisering av nye genetiske mål 4.
The C. elegans genomet inneholder potensiell antipsykotisk medikament (APD) mål bevares hos mennesker, inkludert gener som koder for proteiner som er nødvendige for nevrotransmitter-syntese og for synaptisk struktur og funksjon 5. Således C. elegans nevrogenetikk og nevrobiologi tilbyr metoder for å oppdage nye molekylære virkningsmekanismer av APDS. I nematoder, APD eksponering tidlig i utviklingen gir forsinket utvikling, og ved høyere konsentrasjoner, letalitet 2,6. APD eksponering i voksen alder produserer atferds fenotyper. For eksempel, hemmer klozapin eksponering locomotion og svelg-pumping og forbedrer egglegging 1,2,7.
APD-indusert forsinket utvikling og dødelighet er kraftige fenotyper for store kjemiske genetiske skjermer. Disse fenotyper er komplekse i så langt som de sannsynligvis har mer enn ett mobilnettet og genetiske basis. Derfor, er slike genetiske skjermer forventes å gi en rekke indirekte stoffet mål. Imidlertid har vårt laboratorium gjennomført kandidat genet skjermer og et genom-wide RNAi skjermen for undertrykkere av APD-indusert forsinket utvikling og dødelighet og har med hell gjenopprettet gener som trolig koder direkte mål, inkludert dopamin, insulin, og nikotin-acetylcholin reseptorene 2,8. Genetiske skjermer basert på APD-indusert atferd i den voksne har også ført til identifisering av nye APD mål, og vi er nå validere mål fra både utviklings-og atferds skjermer i pattedyr 7. Dermed ser en invertebrate kjemisk genetisk tilnærming til å oppdage nye molekylære virkningsmekanismer av APDS å være mulig 5,8.
The C. elegans Svelget er et organ som inkluderer 20 nevroner, 20 muskelceller, og 20 tilbehørs celler, innpakket av en basalmembran. På samme måte som pattedyr hjerte, svelget autonom ennd stadig pumper mat inn fra det ytre miljø 9.. Hemming av svelg pumpehastighet kompromisser fødeopptak, og dermed mutasjoner eller medikamenter som hemmer pharyngeal pumping årsaken forsinket utvikling eller arrestere ni. APDS hemme svelg pumpehastigheten, sto delvis for deres effekter på utvikling og levedyktighet 1,2. Her bruker vi den atypisk APD klozapin som et eksempel for å demonstrere narkotika analyser for nematode utvikling og svelg-pumping.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi Metodene for å undersøke effekten av APDS på utviklingen og virkemåten til C. elegans. DMSO eller etanol benyttes for å oppløse klozapin, ettersom medikamentet er relativt uoppløselig i vann. Fordi oppløsningsmidler har vært rapportert å påvirke C. elegans biology 12, DMSO-alene eller etanol stående kontrollgrupper er avgjørende. Den høyeste konsentrasjon av DMSO som brukes i våre analyser er opp til 3%, noe som ikke har en klar betydning for C. elegans</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av en NIH Klinisk Scientist Development award K08NS002083, en Shervert Frazier Research Institute Grant, og en NARSAD Young Investigator Award til Edgar A. Büttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. . C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
