Les protéines peuvent soit adopter une structure native, soit se replier en amyloïde insoluble. Les conditions qui favorisent la voie de mauvais repliement conduisent à la formation de différents types de fibrilles amyloïdes. Les méthodes décrites ici permettent une conversion rapide des protéines natives en amyloïde in vitro.
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Article de méthode
Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les protéines accomplissent des tâches cruciales dans les organismes en exerçant des fonctions induites à partir de leurs plis tridimensionnels spécifiques. Bien que les structures natives des polypeptides remplissent de nombreuses fonctions, il est maintenant reconnu que la plupart des protéines peuvent adopter un assemblage alternatif d’amyloïde riche en feuillets bêta. Les fibrilles amyloïdes insolubles sont initialement associées à de multiples affections humaines, mais elles sont de plus en plus montrées comme des acteurs fonctionnels participant à divers processus cellulaires importants. De plus, l’amyloïde déposée dans les tissus des patients contient des composants non protéiques, tels que les acides nucléiques et les glycosaminoglycanes (GAG). Ces cofacteurs peuvent faciliter la formation d’amyloïde, ce qui entraîne la génération de différents types de précipités insolubles. En tirant parti de notre compréhension de la façon dont les protéines se replient mal via un stade intermédiaire de précurseur soluble de l’amyloïde, nous avons mis au point une méthode pour convertir les protéines natives en fibrilles amyloïdes in vitro. Cette approche permet de préparer de l’amyloïde en grandes quantités, d’examiner les propriétés de l’amyloïde générée à partir de protéines spécifiques et d’évaluer les changements structurels accompagnant la conversion.
Introduction
Les protéines sont les macromolécules biologiques les plus abondantes présentes dans tous les types de cellules. Ils se présentent dans une grande variété de tailles, de structures et de modifications post-traductionnelles, et remplissent une énorme gamme de fonctions biologiques importantes lorsqu’ils sont dans leurs formes natives. Plus de deux douzaines de polypeptides aberrants ont été impliqués dans de nombreuses conditions pathologiques humaines, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète de type 21-4. Les protéines terminales mal repliées s’accumulent sous forme de fibrilles amyloïdes, les agrégats stables insolubles qui....
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Protocole
1. Préparer le tampon MES
- Utilisez un tampon MES (0,1 M d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,9 M de NaCl) pour préparer à la fois des oligomères amyloïdes protéiques uniquement protéiques et des oligomères de protéines solubles stabilisées. Peser 1,95 g de MES et 5,27 g de NaCl. Ajouter H2O et ajuster le pH à 4,7. Porter le volume final à 100 ml. Conserver à 4º C jusqu’à 6 mois.
2. Préparer de l’amyloïde uniquement protéique directement à partir de protéines natives
- Peser la protéine de votre choix (toute protéine native ou peptide) et la reconstituer à 10 mg/ml dans un tampon MES.
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Résultats
La capacité de convertir directement des protéines natives en amyloïde repose sur le changement de conformation induit à haute température dans le tampon MES. La précipitation dans la solution constitue un bon indicateur d'agrégation protéique et éventuellement de formation d'amyloïde. En revanche, afin de stabiliser les oligomères protéiques solubles, l'EDC est utilisé pour réticuler les protéines et fixer la conformation oligomérique induite dans le tampon MES. En conséquence, les oligomères protéiques stabilisés sont .......
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Discussion
La méthode décrite ici offre un moyen rapide et flexible de préparer des fibrilles amyloïdes in vitro à partir de pratiquement n’importe quelle protéine ou peptide de votre choix. Plusieurs types différents d’amyloïde peuvent être préparés de manière fiable - des fibrilles uniquement protéiques ou des agrégats hybrides contenant de l’ADN, de l’ARN ou des glycosaminoglycanes. Les procédures sont simples, directes et ne nécessitent pas de formation technique avancée. L’amyloïde préparée par cette méthode est assez.......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par des subventions accordées à W.C. par les National Institutes of Health Grant AI074809 et le programme de subventions de recherche institutionnelle M. D. Anderson Cancer Center de l’Université du Texas.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Chlorhydrate de carbodiimide 1-éthyl-3-[3-diméthyl-aminopropyl] (EDC) | Thermo/Pierce | 22980 | |
| ADN de sperme de saumon | Sigma | D1626 | |
| ARN de levure torula | Sigma | R6625 | |
| Héparine de la muqueuse intestinale porcine | Sigma | H3149 | |
| Base Tris | Fisher | BP152-1 | |
| Équipement : | |||
| Bain-marie | Fisher Science | Isotemp 210 | |
| Slide-A-Lyzer cassette de dialyse | Thermo/Pierce | 66380 |
Références
- Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
- Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
- Goldberg, A. L.
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Réimpressions et autorisations
