Kosttilskud af polyumættede fedtsyrer i<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> er en nyttig model til at udforske funktionerne i flerumættede fedtsyrer i udvikling og fysiologi. Denne protokol beskriver en effektiv metode til at supplere <em> C. elegans </ em> kost med flerumættede fedtsyrer.
Abstract
Fedtsyrer er essentielle for mange cellulære funktioner. De tjener som effektive energilagring molekyler, gøre op den hydrofobe kerne af membraner, og deltage i forskellige signalveje. Caenorhabditis elegans syntetiserer alle de enzymer, der er nødvendige for at producere en række af omega-6 og omega-3 fedtsyrer. Dette, kombineret med det enkle anatomi og vifte af tilgængelige genetiske redskaber, gør det til en attraktiv model for at studere fedtsyre funktion. For at undersøge den genetiske veje, der medierer de fysiologiske virkninger af kosten fedtsyrer, har vi udviklet en metode til at supplere C. elegans kost med umættede fedtsyrer. Tilskud er et effektivt middel til at ændre fedtsyresammensætningen af orme og kan også anvendes til at redde defekter i fedtsyrer-deficient mutanter. Vores metode anvender nematodevækst medium agar (NGM) suppleret med fedtsyre acidsodium salte. Fedtsyrerne i suppleret pladerne bliver integreringented i membraner i bakterielle fødekilde, som derefter taget op af C. elegans, der lever af de suppleret bakterier. Vi beskriver også en gaskromatografi protokol til at overvåge ændringer i fedtsyresammensætningen som opstår i suppleret orme. Dette er en effektiv måde at supplere kosten til både store og små bestande af C. elegans, der giver mulighed for en række applikationer til denne metode.
Introduction
Fedtsyrer er essentielle strukturelle komponenter af membraner samt en effektiv energilagerindretning molekyler. Derudover kan fedtsyrer spaltes fra cellemembranerne af lipaser og enzymatisk modificeret til at producere signalerer effektorer 1. Naturligt forekommende polyumættede fedtsyrer (PUFA) indeholder to eller flere cis-dobbeltbindinger. Omega-3-fedtsyrer og omega-6 fedtsyrer er skelnes fra hinanden baseret på positionerne af dobbeltbindinger med hensyn til methylenden af fedtsyren. Sund kost kræver både omega-6 og omega-3 fedtsyrer. Men vestlige kost er særligt rige på omega-6 fedtsyrer og fattig på omega-3 fedtsyrer. En høj omega-6 omega-3 fedtsyre-forhold er forbundet med øget risiko for hjerte-kar-og inflammatoriske sygdomme, er imidlertid de præcise gavnlige og skadelige funktioner af specifikke fedtsyrer ikke godt forstået 2. Spolorm Caenorhabditis Elegans er nyttig i at studere fedtsyre funktion, fordi det syntetiserer alle de enzymer, der er nødvendige for at producere en række af omega-6 og omega-3-fedtsyrer, herunder en omega-3 desaturase, en aktivitet, der er fraværende i de fleste dyr 3,4. Mutanter, der mangler fedtsyredesaturase-enzymer ikke producere specifikke PUFA'er, hvilket fører til en række udviklingsmæssige og neurologiske defekter 4-6.
At studere de fysiologiske effekter af kosten fedtsyrer, har vi udviklet et biokemisk assay kompatibel med genetisk analyse ved hjælp af både mutant og RNAi knock-down teknikker i C. elegans. Tilskud af specifikke PUFA'er er opnået ved tilsætning af en fedtsyre natriumsaltopløsning til agarmediet før udhældning. Dette resulterer i PUFA optagelse af E. coli fødekilde, når den akkumuleres i bakterielle membraner. C. elegans indtager de PUFA-holdige bakterier, og dette kosttilskud er tilstrækkelig til at redde defekttværsnit af PUFA-mutanter. Tilskud af de fleste fedtsyrer har ingen skadelige virkninger på vildtype dyr dog specifikke omega-6 fedtsyrer, især dihomo-gamma linolensyre (DGLA, 20:03 n-6) forårsage en permanent ødelæggelse af C. elegans kønsceller 7,8.
Gaschromatografi bruges til at overvåge udbredelsen af det supplerede fedtsyre i bakterielle fødekilde (enten OP50 eller HT115) samt i nematoder. Tilsætningen af detergent Tergitol (NP-40) i medierne giver mulighed for jævn fordeling af fedtsyrer gennem hele pladen og mere effektiv optagelse af fedtsyrer ved E. coli og nematoder. Vi har fundet, at umættede fedtsyrer let optages af bakterier og C. elegans, men optagelsen af mættede fedtsyrer er meget mindre effektiv. Denne artikel vil beskrive trin-for-trin, hvordan man supplere agar medier med fedtsyrer, samt hvordan man kan overvåge fedtsyre optagelse i the nematode hjælp gaskromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåde til supplering af C. elegans med kosten umættede fedtsyrer. Som nævnt ovenfor, skal man passe på i udarbejdelsen af PUFA suppleret plader fordi den reaktive karakter af dobbeltbindinger i flerumættede fedtsyrer forårsager disse fedtsyrer for at være følsomme over for oxidation gennem varme og lys 11. For at undgå oxidation, er det vigtigt at tilsætte PUFA'en til væsken agarmedium, når mediet er afkølet til 55 ° C og lagrer plader i et mørkt miljø….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Chris Webster til at udføre de indledende forsøg er vist i figur 3 i de repræsentative resultater, og Jason Watts og Chris Webster for nyttige kommentarer til manuskriptet. Finansieringen af denne undersøgelse blev leveret af en bevilling fra National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) til JLW. Nogle nematode stammer, der anvendes i dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetik Center, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40 OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Génétique. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Génétique. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Génétique. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
