Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em> Caenorhabditis Элеганс</em
Summary
<em> Caenorhabditis Elegan </ EM> является полезной моделью для изучения функции полиненасыщенных жирных кислот в развитии и физиологии. Этот протокол описывает эффективный метод дополняющий <em> C. Элеганс </ EM> диета с полиненасыщенными жирными кислотами.
Abstract
Жирные кислоты необходимы для многочисленных клеточных функций. Они выступают в качестве эффективных молекул хранения энергии, составляют гидрофобного ядра мембран, а также участвовать в различных сигнальных путей. Caenorhabditis Элеганс синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот. Это, в сочетании с простой анатомии и диапазон доступных генетических инструментов, делают его привлекательным моделью для изучения функции жирных кислот. Для того чтобы исследовать генетические пути, которые опосредуют физиологические эффекты биологически активных жирных кислот, мы разработали метод в целях пополнения C. Элеганс диета с ненасыщенных жирных кислот. Дополнение является эффективным средством для изменения состава жирных кислот червей, а также может быть использован, чтобы спасти дефекты в кислых дефицитом мутантов жирных. Наш метод использует нематод роста среднего агар (NGM) с добавлением жирных acidsodium солей. Жирные кислоты в дополненных пластин стать IncorporaТед в мембраны бактериальной источника пищи, который затем, с которой соприкасается С. Элеганс, которые питаются на дополненных бактерий. Мы также описываем протокол газовой хроматографии для мониторинга изменений в составе жирных кислот, которые происходят в дополненных червей. Это эффективный способ пополнить рацион больших и малых популяций C. Элеганс, что позволяет для ряда приложений для этого метода.
Introduction
Жирные кислоты необходимы структурные компоненты мембран, а также молекулы эффективного хранения энергии. Кроме того, жирные кислоты можно отщепить от клеточных мембран по липаз и быть ферментативно модифицированы с получением сигнализации эффекторы 1. Природные полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) содержат два или более цис двойные связи. Омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты отличаются друг от друга на основе позиции двойных связей по отношению к концевой метильной группы жирной кислоты. Здоровые диеты требуют как омега-6 и омега-3 жирных кислот. Тем не менее, западные диеты особенно богаты омега-6 жирных кислот и бедными в омега-3 жирных кислот. Высокий омега-6 омега-3 соотношение жирных кислот в связано с повышенным риском сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний, однако, точные полезные и вредные функции конкретных жирных кислот не до конца понятны 2. Аскариды Caenorhabditis Elegaнс является полезной при изучении функции жирных кислот, потому что она синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот, в том числе омега-3 десатуразой, деятельность, отсутствует у большинства животных 3,4. Мутанты, лишенные жирные десатурации кислоты ферменты не дают конкретных ПНЖК, что приводит к целому ряду развития и неврологических дефектов 4-6.
Для изучения физиологических эффектов диетических жирных кислот, мы разработали биохимический анализ, совместимый с генетического анализа с использованием как мутант и RNAi нокдауна методы в С. Элеганс. Дополнение с конкретным ПНЖК достигается путем добавления жирных кислот раствора натриевой соли в агаровой среде до заливки. Это приводит к поглощению ПНЖК в Е. палочка источником пищи, где он накапливается в бактериальных мембранах. С. Элеганс глотать ПНЖК-содержащих бактерии, и это диетических добавок достаточно, чтобы спасти неисправенц из ПНЖК-дефицитных мутантов. Дополнение большинства жирных кислот не имеет пагубные последствия для дикого типа животных, однако, конкретные омега-6 жирных кислот, особенно дигомо-гамма-линоленовой кислоты (DGLA, 20:03 н-6) вызывают постоянное разрушение С. Элеганс половые клетки 7,8.
Газовая хроматография используется для контроля поглощения в дополненной жирной кислоты в бактериальной источника питания (или OP50 или HT115), а также в нематод. Добавление моющего средства Tergitol (NP-40) в средствах массовой информации позволяет равномерное распределение жирных кислот через всю пластину и более эффективное поглощение жирных кислот со стороны Е. палочка и нематоды. Мы обнаружили, что ненасыщенные жирные кислоты могут быть легко поглощается бактериями и С. Элеганс, но поглощение насыщенных жирных кислот гораздо менее эффективным. Эта статья описывает шаг за шагом, как дополнение к среде агара с жирными кислотами, а также, как контролировать поглощение жирных кислот в гое нематода с помощью газовой хроматографии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем метод добавок C. Элеганс с диетическими ненасыщенных жирных кислот. Как упоминалось выше, необходимо соблюдать осторожность при подготовке ПНЖК, дополненной пластин, так как реактивный характер двойных связей в ПНЖК вызывает эти жирные кислоты чувствительны к оки?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Крис Вебстер для выполнения предварительных экспериментов показано на рисунке 3 представительных результатов и Джейсон Уоттс и Крис Вебстер за полезные замечания по рукописи. Финансирование данного исследования была предоставлена за счет гранта от Национального института здоровья (США) (R01DK074114) в JLW. Некоторые штаммы нематод, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется по NIH Управления научно-исследовательских программ в области инфраструктуры (P40 OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Génétique. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Génétique. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Génétique. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
