Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> geliştirme ve fizyolojisi çok-doymamış yağlı asitlerin fonksiyonlarını keşfetmek için uygun bir modeldir. Bu protokol <em> C tamamlayan etkili bir yöntem tarif elegans </ em> çoklu doymamış yağ asitleri ile diyet.
Abstract
Yağ asitleri çok sayıda hücre fonksiyonları için gereklidir. Bu membran hidrofobik özünü oluşturan ve çeşitli sinyal yoluna katılabilir, verimli enerji depolama molekülleri karşılık vermektedir. Caenorhabditis elegans omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler. Bu, basit anatomi ve mevcut genetik araçları yelpazesi ile birlikte, bu yağ asidi işlevini incelemek için çekici bir model olun. Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilere aracılık genetik yollarının araştırılması amacıyla, C takviyesi için bir yöntem geliştirdik Doymamış yağ asitleri ile elegans beslenme. Takviyesi solucanlar yağ asidi bileşimini değiştirmek için etkili bir araç ve aynı zamanda yağlı asit eksikliği olan mutantlar kusurları kurtarmak için kullanılabilir. Önerilen yöntem, yağ acidsodium tuzları ile takviye edilmiş nematod büyüme ortamı, agar (NGM) kullanır. Takviye edilmiş plakalarda yağ asitleri incorpora olmakted sonra C. tarafından alınır, bakteriyel besin kaynağı, zarların içine takviye bakteriler üzerine yem elegans. Biz de desteklenmiş solucanlar meydana yağ asidi kompozisyonundaki değişiklikleri izlemek için bir gaz kromatografisi protokol açıklar. Bu C. büyük ve küçük popülasyonların diyetlerine ek etkili bir yoldur elegans, bu yöntem için bir dizi uygulama için izin verir.
Introduction
Yağ asitleri temel yapı membran bileşenleri hem de verimli enerji depolama moleküllerdir. Ek olarak, yağ asitleri, lipazlar tarafından hücre zarlarından parçalanabilen ve enzimatik olarak işaret efektör 1 üretilmesi için değiştirilebilir. Doğal olarak oluşan çok-doymamış yağlı asitleri (PUFAlar) iki veya daha fazla cis çift bağ ihtiva edebilir. Omega-3 yağ asitleri ve omega-6 yağ asitleri, yağ asidi metil sonuna göre çift bağların pozisyonlara göre birbirinden ayırt edilmektedir. Sağlıklı beslenme omega-6 ve omega-3 yağ asitleri hem de gerektirir. Ancak, Western diyetler omega-6 yağ asitleri ve omega-3 yağ asitleri zayıf özellikle zengindir. Yüksek bir omega-6 omega-3 yağ asidi oranı, kardiyovasküler ve enflamatuar hastalıkların riski Bununla birlikte, belirli yağ asitlerinin tam yararlı ve zararlı işlevleri de 2 anlaşılmamıştır ile ilişkilidir. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegabir omega-3 desatürazı, çoğu hayvan 3,4 in mevcut olan bir aktivitesi omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler için ns yağlı asit fonksiyonu çalışmalarında yararlıdır. Yağlı asit desatüraz enzimleri eksik olan mutantlar, gelişim ve nörolojik kusurlar 4-6 bir dizi yol açan, özel PUFAların üretilmesi için başarısız.
Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilerini incelemek için, C de mutant ve RNAi yok etme teknikleri kullanarak genetik analizi ile uyumlu bir biyokimyasal analiz geliştirdik elegans. Özel PUFAlar ile takviyesi dökülmesinden önce agar ortamına bir yağlı asit sodyum tuzu çözeltisinin eklenmesi ile elde edilir. Bu, E. tarafından PUFA alımı ile sonuçlanan Bu bakteri membran birikir coli besin kaynağı. C. elegans PUFA içeren bakteri yemek ve bu diyet takviyesi arızalı kurtarmak için yeterlidirPUFA eksikliği mutantlarının ts. En çok yağlı asitlerin takviyesi, ancak, belirli bir omega-6 yağ asitleri, özellikle dihomo-gama linolenik asit (DGLA, 20:03 n-6) C arasında kalıcı bir imha neden yabani tip hayvanlar üzerinde herhangi bir zararlı etkisi yoktur elegans germ hücreleri 7,8.
Gaz kromatografisi bakteriyel besin kaynağı (OP50 veya HT115 olarak) hem de nematod takviye yağ asidi alımını izlemek için kullanılır. Medyada deterjan Tergitol (NP-40) 'nin ilave edilmesi, tüm plaka ve E ile yağlı asitlerin daha etkin alınması yoluyla yağlı asitlerin dağılımını sağlar: coli ve nematodlar. Biz, doymamış yağ asitleri kolayca bakteri ve C. tarafından alınır bulduk elegans, fakat doymuş yağlı asitlerin alımını çok daha az etkilidir. Bu makalede, yağ asitleri ile agar ortamı tamamlamak için nasıl adım adım tarif, hem de inci yağ asidi alımını izlemek için ne kadar olacakgaz kromatografisi kullanılarak e nematod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada C takviyesi için bir yöntem tarif Diyet doymamış yağ asitleri ile elegans. Yukarıda belirtildiği gibi, PUFAların en çift bağların reaktif doğası, bu yağ asitleri, ısı ve ışık 11 ile oksidasyona karşı duyarlı olması neden olur, çünkü bakım PUFA takviye plakaları hazırlanmasında alınmalıdır. Oksidasyonu önlemek için, ortam karanlık bir ortamda 55 ° C ve depolar plakalara soğuduktan sonra, sıvı agar ortamına PUFA eklemek için önemlidir.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının yararlı yorumlar için temsili sonuçlar Şekil 3 ve Jason Watts ve Chris Webster gösterilen ön deneyler için Chris Webster teşekkür ederim. Bu çalışma için fon JLW için Ulusal Sağlık Enstitüleri (ABD) (R01DK074114) bir hibe sağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod ırkları Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı.
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Génétique. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Génétique. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Génétique. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
