Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Summary

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Abstract

Neuere Arbeiten zeigen, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) Regeneration und Tumorgenese beinhaltet Populationen von Stammzellen (SC) mit Wohnsitz im erwachsenen Gehirn. Aber die Mechanismen, diese normalerweise ruhenden Zellen beschäftigen, um die ordnungsgemäße Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, sowie ihre Rolle in der Erholung von Verletzungen und Eindämmung von neurodegenerativen Prozessen sicherzustellen wenig verstanden. Diese Zellen befinden sich in Regionen als "Nischen", die eine tragende Umwelt mit modulierenden Signale sowohl von der Gefäß-und Immunsystem bieten bezeichnet. Die Isolierung, die Wartung und die Differenzierung von ZNS VZ unter definierten Kulturbedingungen, die unbekannte Faktoren auszuschließen, zugänglich macht Behandlung durch pharmakologische oder genetische Mittel, um Einblicke in ihre in vivo-Verhalten. Hier bieten wir detaillierte Informationen über die Methoden zur Erzeugung von Kulturen von ZNS-VZ aus verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns und Ansätze zu ihrer d beurteilenifferentiation Potential in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vitro. Diese Technik ergibt eine homogene Zellpopulation als eine Monokultur, die sichtbar auf einzelne SCs und ihre Nachkommen zu untersuchen. Darüber hinaus kann es in verschiedenen Tiermodellsystemen und klinischen Proben angewendet werden kann, wobei zuvor zur regenerativen Antworten in der geschädigten adulten Nervensystems vorherzusagen.

Introduction

Das zentrale Dogma der Neurobiologie, den von den grundlegenden Beobachtungen des Gehirns Zytoarchitektur von Ramón Y. Cajal vor über einem Jahrhundert gemacht gelegt, entschieden, dass die Neurogenese unwahrscheinlich war, nach der Adoleszenz angesichts der Komplexität der neuronalen Netze im ZNS ¹ gefunden. Trotz der Arbeit von Altman in den 1960er Jahren und später Kaplan, die zeigen, dass ³ H-Thymidin konnte in reifen Neuronen darauf hinweist, dass in der Tat Neuronen wurden in verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns erzeugt gefunden werden, das Dogma weiterhin halten ^{2, 3.} Evidence weiterhin mit Forschungs Nottebohms die jahreszeitlichen Veränderungen in der Anzahl der Singvogel in Gehirnen ⁴ vorhanden Neuronen beschreiben, zu montieren. Es war nicht bis 1999, als Gould et al. Veröffentlichten Arbeiten über die Erzeugung von Neuronen im Hippocampus steigt mit der Leistung der assoziativen Lernaufgaben in Ratte, sowie die Beobachtungen von Kornack und Rakic ​​DemonstrationTing fortgesetzt Neurogenese im erwachsenen Makaken, die das Konzept einer weniger starren, plastischer Gehirn wurde erkannt ^{5, 6.}

Die Suche nach der zellulären Quelle für diese de novo generierten Neuronen führen zur Entdeckung einer diskreten Population von Stammzellen (VZ), die in Bereichen des Gehirns befinden sich die als Nischen ^7. Die Subventrikularzone und Unter körnige Zone des Hippocampus gelten als die beiden wichtigsten neurogenen Regionen ^8,9 sein. Zellen aus diesen Standorten isoliert zeigen die klassische Merkmal der embryonalen oder fötalen abgeleitet VZ, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial. Im Fall von neuralen Stammzellen (NSC), können sie in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Darüber hinaus sind diese VZ Fleck positive fötale NSC Marker wie der Zwischen Filamentprotein Nestin ^10. Neuere Arbeiten betont, dass SCs vielleicht nicht zu diesen t begrenzt werdenWO Bereiche auf und sind in der Tat im gesamten Gehirn lokalisiert als weitgehend ruhenden Zellpopulation fest mit dem Gefäßsystem ¹¹ verbunden.

Die Beobachtungen, die VZ in Reaktion auf eine Verletzung mobilisiert legt die Möglichkeit, in der Lage, diese Zellen für regenerative Zwecke zu nutzen, um bei der Rückgewinnung von neurodegenerativen Erkrankung und Schlaganfall ^{12, 13} zu unterstützen. Das ist nicht anders als die Rolle, die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) bei der Heilung von Bindegewebe spielen, die als perivaskuläre Zellen, die das Potenzial haben, Osteoblasten, Chondrozyten, und Fettzellen werden ¹⁴ zu finden sind. Jedoch NSC nicht in der gleichen Weise wie MSCs aus dem Knochenmark durch Routine Aspiration und Dichtegradientenzentrifugation Techniken geerntet und anschließend in autologe Zelltherapien verwendet. Als Folge müssen auch andere Zellen, wie etwa die Verwendung von fetalen NSC oder neuronalen Vorläuferzellen abgeleitet von embryonic Stammzellen wurden ausführlich in der Tier Krankheiten und Verletzungen Modelle mit unterschiedlichem Erfolg ¹⁵ erforscht. Induzierte pluripotente Stammzellen-Technologien nutzen somatischen Zellquellen bieten eine weitere Möglichkeit dazu bietet der zur Herstellung therapeutisch nützlichen Zell-basierte Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen, die Überwindung der begrenzten Verfügbarkeit und ethische Bedenken hinsichtlich der Verwendung von embryonalen Zellen und fetalen Gewebe ^16. Allerdings klinische Umsetzung dieser Erkenntnisse hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, wie in den Kämpfen der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen mit SC-basierten therapeutischen Ansätze gezeigt, ^17,18 sowie einen gewundenen Pfad zu Regulierungsfreiheit. Als Alternative kann die Einführung von spezifischen pharmakologischen Behandlungen NSC Zahlen modulieren und zu erleichtern Erholung in Modellen der Parkinson-Krankheit und Schlaganfall ^19. Was auch immer die Strategie könnte sein, zu verstehen, wie diese Zellen effektiv zu manipulierenerfordert eine in vitro-System zugänglich.

Kulturen von NSC kann entweder als Aggregatkulturen, auch bekannt als Neurosphären, oder als Monoschicht ^8,20 durchgeführt werden. Beide Verfahren sind weit verbreitet, die die Einführung von definierten Kulturbedingungen, zB die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Mitogen Quelle, die für die Expansion von multi Vorstufen bereitzustellen. Während Neurosphärenkulturen zur Untersuchung klonale Vermehrung Fähigkeit eines isolierten Zelltyp besser geeignet ist das System gezeigt, um eine gemischte Population von Zellen während der Expansion ²¹ zu erzeugen. Darüber hinaus ist die geschlossene Struktur von Neurosphären die pharmakologische Manipulation der Zellen unpraktisch, und die Interpretation der Einfluss diese Faktoren haben könnten, aufgrund der in der Neurosphäre etabliert Mikroumgebung verwechselt werden. Monolayer-Kulturen, andererseits kann seinin der Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Signalübertragungsmechanismen, die SC Wachstum und Differenzierung regulieren und eröffnet die Möglichkeit, neue Verbindungen, die speziell auf diese Zellpopulation entdecken, zu erkunden.

Als Folge kann die Fähigkeit, reproduzierbar Kulturen adulter NSC aus unterschiedlichen Bereichen von Interesse im Gehirn generiert in einem breiten Spektrum von Forschungsanwendungen verwendet werden, die von Entwicklungsstudien des zentralen Nervensystems (ZNS) zu erforschen neuartige regenerative Medizin Ansätze . Die hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie zu sezieren und bewerten die Differenzierungspotenzial von ZNS-VZ von der erwachsenen Gehirn von Nagetieren isoliert.

Protocol

Die Arbeit hält sich an die Erklärung der Helsinski und der ARVO Tiererklärung. Die Tiere wurden für die Gewebesammlung nach den Anweisungen der Tierhaltung an der Universität Dresden verwendet und alle relevanten Methoden verfolgt. Die Tiere wurden behandelt und untergebracht nach den Bundesrichtlinien für die Nutzung und Pflege von Labortieren, und die Studie wurde von der Landesdirektion Dresden genehmigt. Bitte wenden Sie sich an die Veterinärpolitik Ihrer Institution (IACUC oder andere board) zu entsprechend…

Representative Results

Identifizieren des interessierenden Bereichs, von dem neuralen Stammzellen zu ernten ist die kritische erste Stufe und die Zeit, die es braucht, um einen konfluenten Platte von Zellen zu definieren. Zum Beispiel ist das SVZ eine klassische neurogener Bereich und hat daher einen höheren relativen Anteil von neuralen Stammzellen. Jedoch kann das hier vorgestellte Verfahren mit anderen Regionen nicht oft eine robuste neurogene Potential im Erwachsenenalter erkannt werden. Für die Zwecke dieses Protokolls haben wir die Co…

Discussion

Viele der Schritte für eine erfolgreiche Isolierung, Expansion und Differenzierung von neuronalen Stammzellen aus adulten Gehirn sind gemeinsam mit Standardgewebekulturtechniken geteilt. Das Ziel zu bedenken ist, dass NSCs aus dem erwachsenen Gehirn isoliert als viele ihrer in-vivo-Eigenschaften wie möglich (2J) zu halten. Oft ist eine Balance zwischen notwendigen Vorsicht und angemessener Geschwindigkeit muss gefunden werden. Pflege mit der Isolierung des Gehirn aus dem Schädel machen die I…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit