Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Résumé

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Résumé

Des travaux récents montrent que le système nerveux central (SNC), la régénération et la tumorigenèse implique des populations de cellules souches (SC) résidant dans le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes de ces cellules normalement quiescentes emploient pour assurer le bon fonctionnement des réseaux de neurones, ainsi que leur rôle dans la récupération de blessures et d'atténuation des processus neurodégénératifs sont peu compris. Ces cellules se trouvent dans les régions appelées «niches» qui offrent un environnement maintien impliquant des signaux modulateurs à la fois le système vasculaire et le système immunitaire. L'isolement, l'entretien et la différenciation des CS CNS dans des conditions de culture définies qui excluent facteurs inconnus, qui les rend accessibles à un traitement par des moyens pharmacologiques ou génétiques, fournissant ainsi un aperçu de leur comportement in vivo. Nous vous proposons ici des informations détaillées sur les méthodes pour générer des cultures de Centres de SNC régions distinctes du cerveau adulte et approches pour évaluer leur dpotentiel de ifferentiation dans les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et in vitro. Cette technique donne une population cellulaire homogène d'une culture en monocouche qui peut être visualisée à étudier SC individuel et leur descendance. En outre, il peut être appliqué sur différents systèmes de modèles animaux et des échantillons cliniques, utilisé précédemment pour prédire des réactions de régénération dans le système nerveux adulte endommagé.

Introduction

Le dogme central de la neurobiologie, prévue par les observations fondamentales de la cytoarchitecture de cerveau fait par Ramón Y. Cajal il ya plus d'un siècle, a estimé que la neurogenèse est peu probable après l'adolescence étant donné la complexité des réseaux de neurones présents dans le système nerveux central ^1. Malgré les travaux de Altman dans les années 1960, et plus tard Kaplan, ce qui démontre que ^{la 3H-thymidine} pourrait être trouvée dans les neurones matures indiquant que, en fait, les neurones ont été générés dans des zones distinctes du cerveau adulte, le dogme a continué à tenir ^{deux, trois.} La preuve a contin....

Protocole

Le travail adhère à la Déclaration de Helsinski et l'état des animaux ARVO. Les animaux ont été utilisés pour la collecte des tissus et toutes les méthodes pertinentes ont été suivies selon les instructions de l'animalerie de l'Université de Dresde. Les animaux ont été manipulés et logés selon les lignes directrices fédérales allemandes pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire, et l'étude a été approuvé par le Landesdirektion Dresde. S'il vous plaît consulter la politique vétérinaire de votre établissement (IACUC ou autre conseil) en ce qui concerne la méthodologie de l'euthanasie approprié.

Résultats

L'identification de la région d'intérêt à partir de laquelle la récolte de cellules souches neurales est la première étape critique et définir la quantité de temps qu'il faut pour obtenir une plaque de cellules confluentes. Par exemple, la SVZ est une région neurogène classique et a une proportion relativement plus élevée de cellules souches neurales donc. Cependant, la technique présentée ici peut être utilisé avec d'autres régions pas souvent reconnus comme ayant un potentiel neurogène robuste à l'.......

Discussion

Un grand nombre des étapes critiques de l'isolement, de l'expansion et la différenciation des cellules souches neuronales du cerveau adulte sont partagées en commun par des techniques de culture tissulaire standard. L'objectif de garder à l'esprit est que les CNS isolés du cerveau adulte devrait maintenir le plus grand nombre de leurs caractéristiques in vivo que possible (Figure 2J). Souvent un équilibre entre la prudence nécessaire et la vitesse appropriée doit être trouvé. Un.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture tissulaire à 6 puits	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml solution mère préparée dans de l’eau doublement distillée (Stable pendant plusieurs mois à -20 ° ; C). Concentration de travail 0,5 mg/ml dans l’eau (Stable pendant 1 mois à 4 ° ; C).
Fibronectine	R& D Systems	1030-Fn	Ne pas agiter la solution mère
Appareil de filtration	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	Voir la remarque ci-dessous pour la préparation complète du milieu N2
Apo-transferrine	Sigma-Aldrich	T-2036
Insuline	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M solution mère en ddH2O (stable à 20 ° ; C pour 6 mois)
Sélénite de sodium	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µ ; M solution mère dans ddH2O (stable à -20 ° ; C pendant 6 mois)
Progestérone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 & micro ; M solution mère dans l’éthanol (stable à -20° ; C pendant 6 mois)
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
Saline tamponnée au phosphate	Mediatech	21-040-CV
Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)	R& D Systems	233-FB	Concentration de travail 20 ng/ml  ;
Delta4 (Dll4)	R& D Systems	1389-D4	Concentration de travail 500 ng/ml
Angiopoétine 2 (Ang2)	R& D Systems	623-AN	Concentration de travail 500 ng/ml
Inhibiteur	JAK Calbiochem	420099	Concentration de travail 200 nM  ;
Sérum bovin Albumine	Sigma-Aldrich	A-2058
Tubes coniques de 15 et 50 ml	Corning Life	Sciences 430053, 430829
Les autres articles nécessaires comprennent : Instruments de dissection générale, y compris une lame de rasoir et une pince, Rat adulte (3-6 mois ; Sprague-Dawley ou Long Evans), chambre d’intoxication au CO2, hotte à flux laminaire pour la culture cellulaire et incubateur Incubateur (humidifié, 37 ° ; C, 5 % CO2, 5 % O2). Remarque : Pour une préparation complète du milieu N2, ajoutez à un flacon de DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g d’apotransférine, 0,0125 g d’insuline (fraîchement prédissoute dans 1 ml de 10 mM de NaOH), 50 &mu ; l de putrescine, 30 &mu ; l de sélénite de sodium, 100 &mu ; l de stocks de progestérone et 5 ml de solution de pénicilline/streptomycine. Ajustez le pH à 7,2, si nécessaire. Filtrer-stériliser et stocker à 4 ° ; C jusqu’à 3 semaines et protéger de la lumière.
Immunofluorescence Table
Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	15719
Sérum d’âne normal (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution dans le méthanol
Table d’anticorps primaires
Nestin	Chemicon	MAB353	Facteur de dilution : 1:400 Espèce : Souris IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Facteur de dilution : 1:100 Espèce : IgG de lapin
Sox2	R& D Systems	MAB2018	Facteur de dilution : 1:100 Espèce : Souris IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Souris IgG1
&beta ;-tubuline III (TUJ1)	R& D Systems	MAB1195	Facteur de dilution : 1:500 Espèce : Souris IgG2a
Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)	Dako North America	Z0334	Facteur de dilution 1:500 Espèce : Lapin
Table d’anticorps secondaires
Alexa  ;   ; 568	Invitrogen	A-21124	Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti souris IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti souris IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Facteur de dilution : 1:200 Espèce : Chèvre anti Lapin

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