Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.
I pazienti con metastasi cerebrali di carcinomi hanno una prognosi sfavorevole. Tuttavia, il processo nel sito metastatico è appena stata studiata, in particolare, il ruolo del (stromali) cellule residente. Studi in carcinomi primari dimostrano l'influenza del microambiente sulla metastasi, anche sulla prognosi 1,2. Soprattutto i macrofagi associati al tumore (TAM) migrazione di sostegno, l'invasione e la proliferazione 3. È interessante notare che i maggiori siti bersaglio di metastasi possiedono macrofagi tessuto-specifici, come le cellule di Kupffer nel fegato o microglia nel SNC. Inoltre, i siti metastatici possiedono anche altre cellule tessuto-specifici, come astrociti. Recentemente, gli astrociti sono state dimostrate per favorire la proliferazione e la persistenza di cellule tumorali 4,5. Pertanto, le funzioni di questi tipi di cellule tessuto-specifiche sembrano essere molto importante nel processo di metastasi cerebrali 6,7.
Nonostante queste osservazioni,Tuttavia, fino ad ora non c'è idoneo modello in vivo / in vitro disposizione di visualizzare direttamente reazioni gliali durante la formazione di metastasi cerebrale, in particolare mediante microscopia in campo chiaro. Recente in vivo imaging dal vivo delle cellule di carcinoma dimostrato il loro comportamento colonizzazione cerebrale 8. Tuttavia, questo metodo è molto laboriosa, costosa e tecnicamente complessa. Inoltre, questi tipi di esperimenti sugli animali sono limitate a piccole serie e sono dotati di una notevole sollecitazione per gli animali (per impiantazione della lastra di vetro, iniezione di cellule tumorali, anestesia ripetitivo e fissazione a lungo termine). Inoltre, l'imaging in vivo è finora limitata alla visualizzazione delle cellule di carcinoma, mentre non sono ancora stati illustrati interazioni con cellule residenti. Infine, ricerche di cellule di carcinoma umani all'interno animali immunocompetenti sono impossibili 8.
Per queste ragioni, abbiamo stabilito un sistema di co-coltura consipungiglione di una fetta cervello organotipica mouse e cellule epiteliali incorporato in matrigel (sfera di cellule 3D). Le sfere di cellule di carcinoma in 3D sono stati collocati direttamente accanto al bordo fetta cervello al fine di indagare l'invasione del tessuto cerebrale adiacente. Questo ci permette di visualizzare i cambiamenti morfologici e le interazioni tra le cellule gliali e cellule di carcinoma di fluorescenza e anche mediante microscopia in campo chiaro. Dopo l'esperimento di co-coltura, il tessuto cerebrale o sferoidi cellulari 3D possono essere raccolti e utilizzati per ulteriori analisi molecolari (ad es qRT-PCR, IHC, o immunoblot) nonché per indagini mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per monitorare gli eventi all'interno di un tessuto cerebrale vivente per giorni senza effetti deleteri verso le sezioni di cervello. Il modello permette anche la soppressione selettiva e sostituzione di cellule residenti da cellule da un tessuto donatore per determinare l'impatto distinto di un dato genotipo. Infine, il modello di co-coltura è un'alternativa praticabilein vivo approcci durante il test manipolazioni farmacologiche mirate.
Precedenti indagini istologiche di metastasi cerebrali hanno dimostrato rapidi e drastici cambiamenti delle cellule gliali residenti, in particolare di astrociti e microglia 13. Per studiare questi cambiamenti e le interazioni con le cellule di carcinoma, questo sistema di co-coltura romanzo è adatto. Altri campi di ricerca già hanno esperienza di lunga data con organotipica fettine di cervello di ippocampo. Un vantaggio è che i organotipica culture fetta dell'ippocampo del cervello sono vitali ed effettivamente conservato per giorni o settimane, che lo rende adatto per esperimenti a lungo termine. Dall'introduzione di Stoppini del sistema fetta dell'ippocampo organotipica nel 1991, è stato ampiamente utilizzato, per esempio nella ricerca di malattie degenerative. Così, questo sistema di co-coltura innovare rappresenta una modifica di un approccio consolidata con una gamma di applicazioni in biologia tumorale 9,11. La modifica ci ha offerto un modello riproducibile per valutare il grado di invasione tumorale afterwards e colture cresciute dal metodo di interfaccia sono ideali per esperimenti che richiedono una struttura tridimensionale. Diverse tecniche sono state usate per coculture fettine ippocampali organotipiche con altre cellule. Questi includono un sistema indiretto tra macrofagi e la fetta cervello organotipica 14, e un co-coltura diretta di due sezioni diverse dalla regione dell'ippocampo 15. Aggregati di glioma sono stati co-coltivate con fettine di cervello di 16. Questi modelli possono essere utilizzati per analizzare gli eventi cellulari e molecolari delle fettine di cervello, ma non consentono, il contatto fisiologico diretto tra le cellule tumorali, microglia e il parenchima cerebrale. Inoltre, questo metodo consente l'osservazione di microglia, senza contaminazione di midollo osseo periferico monociti / macrofagi. L'uso di CCR2 e CX3CR1 modello di topo transgenico è un miglioramento critico dovuto al fatto che è difficile distinguere la microglia residente di invadere monocitiin base alle loro proprietà simili 17,18,19. Anche se l'iniezione intracerebrale di cellule di carcinoma permette di indagare la progressione del tumore, non si può dire molto sul fatto che le cellule macrofago-come circondate provengono dalla popolazione microglia cerebrale residenti o dal midollo osseo periferico monociti / macrofagi 17. Il team di Kettenmann introdotto un cervello modello fetta organotipica che ha coinvolto inoculando cellule di glioma in fettine di cervello con un micromanipolatore 20. Tuttavia, gliomi maligni primari differiscono per molti aspetti da carcinomi metastatici. In primo luogo, gliomi maligni sono di origine mesenchimale, non metastasi al di fuori del sistema nervoso, e migrano / invadere le cellule come singole senza confine tra tumore e tessuto cerebrale. Per contro, la crescita infiltrante è una caratteristica tipica patologico, e che tali carcinomi solito migrare / invadere come coorti. In secondo luogo, carcinomi spesso cercano di ricostruire le strutture epiteliali del cervello, mentre le cellule glialicercare di separare il tumore dal tessuto cerebrale da una (pseudo) capsula. Considerando le caratteristiche biologiche e morfologiche, glioma maligno e metastasi dei carcinomi non sono realmente comparabili. Per queste ragioni, abbiamo modificato e sviluppato un sistema di co-coltura dove non ci iniettiamo, ma co-coltura di una spina di cellule di carcinoma adiacente la fetta cervello. Inoltre, abbiamo osservato microglia e l'accumulo di astrociti al confine della spina tumore, il che significa che la microglia entrare la spina tumore e potrebbe essere facilmente individuata mediante microscopia in campo chiaro e confermato successivamente mediante microscopia confocale. Le cellule tumorali invadono nella fetta cervello, che è paragonabile alla reale situazione in vivo e ad un'osservazione di Baumert e colleghi, che hanno trovato una zona infiltrazione nel 63% dei casi autoptici con metastasi cerebrali 21.
A causa della mancanza di perfusione di sangue, ci sono solo residenti macrofagi / microglia in questa cultura. Inoltre, a causa della mcellule Issing T e, di conseguenza, assente allo-reattività, cellule di carcinoma umane potrebbero essere utilizzati per co-coltura anche con fettine di cervello di topi immunocompetenti o ratti (NMRI, B6, o Wistar). Questo potrebbe servire come alternativa al modello di topo nudo. Da 4-5 fette possono essere ottenuti da ciascun topo, sono richiesti significativamente ridotto numero di animali, in confronto ai modelli iniezione esistenti. Inoltre, gli animali non soffrono per un lungo periodo di malattia metastatica e non sottoposti a procedure operative ripetutamente 22.
Con questo sistema di co-coltura, abbiamo dimostrato l'attivazione della microglia dalle cellule tumorali e la capacità di promuovere l'invasione delle cellule del cancro. Inoltre, questa è la prima volta, a nostra conoscenza, sono stati trovati per trasportare attivamente cellule di carcinoma 23 microglia.
Nonostante tutti questi vantaggi, il sistema di co-coltura ha, infatti, anche limitazioni. E 'ancora in vitromodellare mancano le fasi di metastasi prima della colonizzazione. A causa della mancanza di perfusione, non è possibile studiare la stravaso. Così, il modo alternativo di studiare la stravaso è di utilizzare il modello in vivo iniezione o il sistema di camera di Boyden modificata con matrice extracellulare, HUVEC e astrociti per imitare la barriera emato-encefalica 22,24. Il metodo coculture fetta cervello è ancora un modello affidabile e riproducibile con molti vantaggi e un potenziale per un'ampia varietà di applicazioni, come l'analisi di colonizzazione, in particolare con un focus sul ruolo delle cellule residenti. La combinazione con altre tecniche consolidate (come l'immunoistochimica, microscopia confocale e microscopia time-lapse) sostiene la ricerca di interazioni dirette cellula-cellula. Si tratta di una alternativa semplice e complementazione di altre tecniche e offre l'accesso alla ricerca di spunti e gli effetti come imposte dal microambiente metastatico.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica, Andreas Wodarz e Stephan Heermann per la loro consulenza tecnica in materia confocale e microscopia time-lapse. Non c'è conflitto di interessi per qualsiasi degli autori. Questo lavoro è finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) in Project 2 Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), dai Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Germania) e dal Programma di Ricerca della Facoltà di Medicina, Georg-August-Universität Göttingen, Germania.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |