To-foton Kalsium Imaging in Mice Navigere en Virtual Reality Environment
Summary
Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrer involvert i to-foton avbildning av mus cortex under atferd i en virtuell virkelighet miljø.
Abstract
I de senere årene, har to-foton bildebehandling blitt et uvurderlig verktøy i nevrovitenskap, som gjør det mulig for kronisk måling av aktiviteten til genetisk identifiserte celler under atferd 1-6. Her beskriver vi metoder for å utføre to-foton bildebehandling i mus cortex mens dyret navigerer en virtuell virkelighet miljø. Vi fokuserer på de aspektene av de eksperimentelle prosedyrer som er nøkkelen til bildebehandling i en oppfører dyret i en sterkt opplyst virtuelt miljø. De viktigste problemene som oppstår i denne eksperimentelle oppsett som vi her adresse er: minimere hjernebevegelsesrelaterte gjenstander, minimere lys lekkasje fra den virtuelle virkeligheten projeksjonssystem, og minimere laser indusert vevsskade. Vi tilbyr også prøve programvare for å styre den virtuelle virkeligheten miljøet og å gjøre elev sporing. Med disse fremgangsmåter og ressurser bør det være mulig å konvertere en konvensjonell to-foton mikroskop for bruk i oppfører mus.
Introduction
To-foton avbildning av kalsium indikatorer (genetisk kodet som GCaMP5 7 eller R-GECO 8, eller syntetiske fargestoffer som OGB eller Fluo4) har dukket opp som en kraftig metode for å måle nerveaktiviteten i oppfører mus 1-6. Det muliggjør den samtidige måling av aktiviteten til flere hundre celler ved nær-enkeltaksjonspotensial-oppløsning, opp til om lag 800 mikrometer under hjernen overflaten 9,10. Dessuten, ved hjelp av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) neuronal aktivitet kan måles kronisk 5,11,12, og genetisk definerte celletyper 13.. Sammen utgjør disse metoder gir en grad av tidsmessig og romlig oppløsning som kan åpnes opp en rekke nye muligheter i studiet av neuronal beregning in vivo.
Kirurgiske inngrep er nødvendig for å avdekke og merke musen hjernen for bildebehandling. Cellene er vanligvis tilført ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert vir oss (AAV) system for Geci levering og et kranie vindu er implantert over injeksjonsstedet for å få optisk tilgang til hjernen. Et hode linje er da festet til skallen for hodefikseringen i henhold til to-foton mikroskop. Utformingen og gjennomføringen av disse trinnene er avgjørende som de fleste av problemene med våken bildebehandling oppstå ustabilitet i utarbeidelsen. Ideelt sett den fremgangsmåte som er beskrevet her bør tillate kronisk avbildning av inntil flere måneder etter operasjonen.
Slik aktiverer visuelt guidet oppførsel under to-foton bildebehandling, sitter hodet fast mus på en luft støttet sfærisk tredemølle, som den kan bruke til å navigere en virtuell virkelighet miljø. Locomotion av musen på tredemølle er koblet til bevegelse i det virtuelle miljøet som vises på en toroidal skjermen rundt muse 14,15. Behavioral variabler som bevegelse, visuell stimulans, og elev posisjon kan registreres seks.
t "> Vi beskriver prosedyrene involvert i kronisk to-foton bildebehandling i mus utforske en virtuell virkelighet miljø De viktigste punktene som tas opp er:. reduksjon av bevegelse gjenstander, reduksjon av lys lekkasje, maksimering av antall samtidig registrert celler, og minimering av bilde skade. Vi gir også informasjon om hvordan du setter opp den luft støttet tredemølle, elev sporing, og den virtuelle virkeligheten miljø. Prosedyrene som beskrives her kan brukes for å avbilde fluorescensmerkede cellepopulasjoner i hodet faste mus i et potensielt bredt spekter av atferds paradigmer .Protocol
Representative Results
Discussion
Nøkkelen til suksess for atferds to-foton avbildning er stabiliteten av preparatet på to måter:
- I løpet av dager etter implantasjon vinduet, kan inflammatoriske reaksjoner i vevet føre til økning av dannelsen av granulasjonsvev og brusk som vil hemme eller hindre avbildning.
- Under eksperimentet har hjernen til å være stabil nok til å hindre bevegelsesfeil fra ødelegge nevral aktivitet relatert fluorescens-signal.
For å holde den inflammatoriske immunre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Max Planck Society, og Human Frontiers Science Program.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
