عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة
Summary
وقد وضعنا رواية وتقنية استنساخه لعزل الثقافات الأولية من الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء (PASMC) من الفئران في سن P7، مما يتيح دراسة أفضل للمسارات الإشارات المشاركة في حديثي الولادة العضلات الملساء انكماش الخلايا والاسترخاء.
Abstract
ارتفاع ضغط الدم الرئوي هو سبب كبير من المراضة والوفيات عند الأطفال الرضع. تاريخيا، كانت هناك دراسة كبيرة من مسارات الإشارات المشاركة في الأوعية الدموية تقلص العضلات الملساء في PASMC من الأغنام الجنين. بينما الأغنام جعل نموذجا ممتازا من ارتفاع ضغط الدم الرئوي المدى، أنها مكلفة للغاية وتفتقر إلى الاستفادة من التلاعب الوراثي الموجود في الفئران. على العكس، كان عدم القدرة على عزل PASMC من الفئران وجود قيود كبيرة من هذا النظام. نحن هنا وصف عزلة الثقافات الأولية من الماوس PASMC من P7، P14، P21 والفئران باستخدام الاختلاف من هذه التقنية هو موضح سابقا من مارشال وآخرون. ال 26 التي كانت تستخدم سابقا لعزل PASMC الفئران. هذه PASMC الفئران تمثل أداة جديدة لدراسة مسارات إشارات في فترة الوليد. لفترة وجيزة، والطين من 0.5٪ (W / V) + الاغاروز هي التي غرست جزيئات الحديد 0.5٪ في M199 سائل الإعلام في السرير الوعائي الرئوي عبر البطين الأيمن (RV). الجزيئات الحديد هي 0.2 ميكرومتر في القطر وليس يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي. وهكذا، فإن النزل الحديد في الشرايين الرئوية الصغيرة (PA). وتضخم الرئتين مع الاغاروز، إزالتها وفصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد إلى أسفل مع المغناطيس. بعد كولاجيناز (80 U / مل) العلاج ومزيد من التفكك، يتم وضع السفن في طبق زراعة الأنسجة في M199 سائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والمضادات الحيوية (M199 وسائل الإعلام كاملة) للسماح الهجرة الخلية على طبق ثقافة . هذه لوحة من الخلايا الأولية هي مزيج من الخلايا الليفية 50-50 وPASMC. وهكذا، فإن هدم الإجراء يتكرر عدة مرات لتحقيق السكان PASMC أكثر نقاء وإزالة أي الحديد المتبقية. يتم تأكيد هوية الخلايا العضلية الملساء التي كتبها المناعية لسلسة العضلات الميوسين وdesmin.
Introduction
ارتفاع ضغط الدم الرئوي أمر طبيعي خلال الحياة داخل الرحم منذ المشيمة بمثابة الجهاز الرئيسي لتبادل الغازات ويتم توزيعها فقط 10٪ من النتاج القلبي من خلال السرير الوعائي الرئوي. في الرحم والضغوط الرئوي تشبه الضغوط النظامية نظرا لارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية . كما تقدم الحمل، وهناك نمو سريع للسلطة الفلسطينية الصغيرة داخل الرئة، وإعداد الجنين لزيادة كبيرة في تدفق الدم الرئوي الذي يحدث عند الولادة 1. عند فشل عملية الانتقال في الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية لدى الرضع على المدى القريب والمدى الكامل، والنتيجة هي ارتفاع ضغط الدم الرئوي الثابتة من الأطفال حديثي الولادة (PPHN). PPHN هو متلازمة سريرية بسبب العديد من الأمراض الكامنة مختلفة. ومع ذلك، كل من هؤلاء الرضع بسمات الفسيولوجية المرضية الشائعة مثل ارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية، نقص الأكسجة، وتحويلة من اليمين إلى اليسار من تدفق الدم عبر اتصالات الجنين المستمرة مثل القناة الشريانية أو للآمين البيضوية. PPHN يؤثر 2-6 لكل 1،000 ولادة حية وينقل مخاطر 8-10٪ من وفيات فضلا كبيرا على المدى القصير وعلى المدى الطويل 2 الاعتلال. بالإضافة إلى ذلك، قد منخفضة جدا الوزن عند الولادة الخدج تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي نتيجة لمرضهم الرئة الكامنة. وأمراض الرئة الكامنة الأكثر شيوعا من الأطفال الخدج هو خلل التنسج القصبي الرئوي. في حين أن المخاطر الكلية للبرميل في اليوم يرتبط مع العمر الحملي ووزن الولادة، يبقى من غير الواضح لماذا مجموعة فرعية من هؤلاء الرضع تطور ارتفاع ضغط الدم الرئوي هامة وكيفية التعامل مع هؤلاء الأطفال بشكل مناسب. النتائج السيئة، بما في ذلك الإقامة في المستشفى لفترات طويلة وزيادة معدل الوفيات، شائعة 3-6.
تاريخيا، استخدمت الأغنام PASMC الجنين أو الخنازير PASMC الجنين من الحيوانات السليمة لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في عملية الانتقال الأوعية الدموية الرئوية الطبيعية بعد الولادة. عادة يتم عزل هذه من الجيل الخامس المقاومة الفلسطينية منن الأغنام أو الخنازير الجنين التي يتم تسليمها والموت الرحيم قبل أي التنفس العفوي 7-9. بالإضافة إلى ذلك، بعض المحققين عزلت والاستفادة منها PASMC من كبار السن قليلا ويتنفس بشكل عفوي الحملان والخنازير في 3 أيام، 2 أسابيع، و4 أسابيع 10-12. وفي الآونة الأخيرة، بعض المجموعات عزلت بنجاح والاستفادة منها PASMC معزولة عن الحملان مع PPHN لدراسة خللا في مسارات إشارات في حالة المرض 13-17. وقد أثبتت هذه الخلايا لتكون أداة قيمة لدراسة مسارات الإشارات التي تشكل عاملا حاسما في كل من الأوعية الدموية الرئوية طبيعية والمريضة على المدى القريب والبعيد. ومع ذلك، فإنها لا تعطي نظرة ثاقبة في مسارات الإشارات أثرت في الأطفال الخدج المصابين بارتفاع ضغط الدم الرئوي. كما أنها لا تسمح إمكانيات التلاعب الجيني ينظر في نماذج الماوس من المرض.
منذ فترة طويلة تستخدم الجرذان والفئران نماذج لنموذج برميل يوميا ويجري استخدامها في الآونة الأخيرة إلى نموذج HY الرئويpertension الناتجة عن برميل يوميا 18-22. الفئران حديثي الولادة هي تحريضية للعمل مع نظرا لحجم أكبر، لكنها تعاني أيضا من عدم وجود إمكانية التعديل الوراثي. تم الحيوانات المعدلة وراثيا المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في الآثار المترتبة على أهداف جين معين على فسيولوجيا الحيوان كله في الفئران حديثي الولادة، ولكن حتى الآن لا أحد سبق له معزولة بنجاح PASMC من هذه الفئران الصغيرة. من خلال عزل PASMC، ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية تغيير مسارات في الاستجابة للمؤثرات البيئية و / أو التعديل الوراثي وتحديدا في العضلات الشريان الرئوي على نحو سلس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير الحية PASMC في الوقت الحقيقي لدراسة التغيرات السريعة في الجزيئات يشير المفتاح مثل الكالسيوم وأنواع الاكسجين التفاعلية 23-25. وصفنا في الآونة الأخيرة عزلة الناجح لPASMC من فئران بالغة باستخدام تباين أسلوب مارشال وآخرون. 26 تستخدم لعزل الفئران PASMC 23،25،26. نحن الآن تكيفت علىتمديد الثانية هذه التقنية على الفئران الصغيرة 7-21 أيام من العمر (P7، P14، P21 و). والقيد الرئيسي لهذه التقنية الجديدة العزلة PASMC هو أنه يتطلب الفئران متعددة لتوليد خلايا كافية لإجراء التجارب وأن الخلايا تنمو ببطء شديد، والذي هو سمة من خلايا العضلات الملساء الأولية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب لعزل PASMC الماوس حديثي الولادة تسمح للتحقيق تعزيز مسارات الإشارات الرئيسيين المشاركين في تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي، ويمثل تقدما كبيرا في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا المخطوط، وصفنا للمرة الأولى عزلة PASMC من الفئران في P7، P14، P21 و. من أجل تحقيق هذا الهدف، وغرست في الطين من الاغاروز و 0.2 ميكرومتر جزيئات الحديد من خلال RV في السلطة الفلسطينية. ونظرا لصغر حجم جزيئات الحديد، فإنها لا يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي، وبالتالي فهي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL109478 (KNF). يعترف الكتاب وشكرا جينا كيم وجوان تايلور لمساعدتها في عزل والمحافظة على PASMC في الثقافة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
