Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Summary

We hebben een nieuwe en reproduceerbare techniek om primaire culturen van pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC) isoleren van muizen zo jong als P7 ontwikkeld, waardoor een betere studie van de signaalwegen betrokken bij neonatale gladde spiercellen samentrekken en ontspannen mogelijk.

Abstract

Pulmonale hypertensie is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij zuigelingen. Historisch gezien, is er sprake van aanzienlijke studie van de signaalwegen betrokken bij vasculaire gladde spiercontractie in PASMC uit foetaal schapen. Terwijl schapen een uitstekende model duur pulmonale hypertensie, ze zijn erg duur en niet de voordelen van genetische manipulatie in muizen. Omgekeerd, het onvermogen om PASMC isoleren van muizen was een belangrijke beperking van dit systeem. Hier beschrijven we de isolatie van primaire kweken van muizen PASMC van P7, P14 en P21 muizen met een variant van de eerder beschreven techniek van Marshall et al.. ²⁶ die eerder werd gebruikt voor rat PASMC isoleren. Deze muizen PASMC vormen een nieuw instrument voor de studie van signaalwegen in de neonatale periode. Kort, een suspensie van 0,5% (w / v) agarose + 0,5% ijzerdeeltjes in M199 medium wordt toegediend in de pulmonale vasculaire bed via de rechter ventrikel (RV). Deijzerdeeltjes zijn 0,2 micrometer in doorsnede en kan niet door de pulmonale capillaire bed. Zo is het ijzer lodges in de kleine longslagaders (PA). De longen worden opgeblazen met agarose, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden naar beneden getrokken met een magneet. Na collagenase (80 U / ml) behandeld en na dissociatie, worden de kolven op een weefselkweekschaal in M199 medium met 20% foetaal bovine serum (FBS) en antibiotica (M199 complete media) gebracht celmigratie doorlaat tot de kweekschaal . Deze eerste plaat van cellen is een 50-50 mengsel van fibroblasten en PASMC. Aldus wordt de pull down procedure meerdere malen herhaald om een ​​meer pure PASMC bevolking te bereiken en verwijder eventueel resterende ijzer. Gladde spiercellen identiteit wordt bevestigd door immunokleuring voor gladde spieren myosine en desmine.

Introduction

Pulmonale hypertensie is normaal tijdens intrauterine leven omdat de placenta fungeert als het belangrijkste orgaan van gasuitwisseling en slechts 10% van het hartminuutvolume wordt gecirculeerd door de pulmonaire vasculaire bed. In utero, pulmonale drukken zijn vergelijkbaar met systemische druk vanwege verhoogde pulmonale vaatweerstand . Als zwangerschap vordert, is er een snelle groei van de kleine PA binnen de longen, de voorbereiding van de foetus voor de dramatische stijging van de doorbloeding van de longen die optreedt bij de geboorte ^1. Wanneer de normale perinatale overgang faalt in korte termijn en voldragen kinderen, het resultaat is persisterende pulmonale hypertensie van de pasgeborene (PPHN). PPHN is een klinisch syndroom dat wordt veroorzaakt door verschillende onderliggende pathologie. Echter, al deze kinderen hebben gemeenschappelijke pathofysiologische kenmerken, zoals verhoogde pulmonale vaatweerstand, hypoxemie, en rechts-naar-links-shunting van de bloedstroom in heel hardnekkige foetale verbindingen zoals de ductus arteriosus of vooramen ovale. PPHN beïnvloedt 2-6 per 1000 levendgeborenen en brengt een 8-10% risico op sterfte en aanzienlijke korte termijn en lange termijn morbiditeit ^2. Bovendien kunnen zeer laag geboortegewicht prematuren pulmonale hypertensie ontwikkelen als gevolg van de onderliggende longaandoening. De meest voorkomende onderliggende longaandoening bij prematuren is bronchopulmonale dysplasie (BPD). Terwijl het totale risico op BPD correleert met de zwangerschapsduur en geboortegewicht, blijft het onduidelijk waarom een ​​subset van deze kinderen ontwikkelt significante pulmonale hypertensie en hoe adequaat te behandelen deze zuigelingen. Slechte resultaten, met inbegrip van langdurige ziekenhuis verblijven en verhoogde mortaliteit, komen vaak voor ^3-6.

Historisch gezien hebben schapen foetale PASMC of varkens foetale PASMC van gezonde dieren die zijn gebruikt om de signaalwegen betrokken bij de normale longvaten overgang na de geboorte te bestuderen. Deze zijn meestal geïsoleerd van de vijfde generatie weerstand PA van eenn schapen of varkens foetus die wordt geleverd en gedood vóór elke spontane ademhaling ^7-9. Daarnaast hebben sommige onderzoekers geïsoleerd en gebruikt PASMC van iets oudere en spontaan ademende lammeren en biggen op 3 dagen, 2 weken, en 4 weken ^10-12. Meer recent, hebben sommige groepen met succes geïsoleerd en gebruikt PASMC geïsoleerd van lammeren met PPHN aan de derangements onderzoeken signaalwegen in de ziekte staat ^13-17. Deze cellen hebben bewezen een waardevol instrument om te onderzoeken welke signaalwegen zijn cruciaal in zowel de normale en zieke op korte termijn en de termijn longvaatbed zijn. Echter, hebben ze geen inzicht geven in de signaalwegen beïnvloed bij prematuren met pulmonale hypertensie. Ook maken zij de mogelijkheden van genetische manipulatie gezien in muismodellen van ziekte.

Rat en muis modellen zijn al lange tijd gebruikt om het model BPD en meer recentelijk worden gebruikt om het model pulmonale hypertension gevolg van BPD ^18-22. Neonatale ratten zijn verleidelijk om mee te werken als gevolg van hun grotere omvang, maar ze ook last hebben van een gebrek aan mogelijkheden voor genetische modificatie. Genetisch gemodificeerde dieren zijn uitgebreid gebruikt om de effecten van bepaalde gendoelstellingen in gehele dierlijke fysiologie bij neonatale muizen te onderzoeken, maar tot nu toe niemand eerder succesvol geïsoleerd PASMC Uit deze muizen. Door het isoleren PASMC kan meer informatie worden verkregen over routes veranderen als reactie op prikkels uit de omgeving en / of genetische modificatie specifiek in de longslagader gladde spieren. Daarnaast kan levend PASMC worden afgebeeld in real time om snelle veranderingen in belangrijke signaalmoleculen zoals calcium en zuurstofradicalen ^23-25 ​​te onderzoeken. We hebben onlangs beschreven succesvolle isolatie van PASMC van volwassen muizen met een variant van de techniek van Marshall et al.. ²⁶ gebruikt voor het isoleren rat PASMC ^23,25,26. We hebben nu een aangepastnd uitgebreid deze techniek om kleine muizen 7-21 dagen leeftijd (P7, P14 en P21). De belangrijkste beperking van deze nieuwe PASMC isolatietechniek is dat het meerdere muizen voldoende cellen voor experimenten genereren en dat de cellen groeien zeer langzaam, die kenmerkend primaire gladde spiercellen. Ondanks deze beperkingen, geloven wij deze techniek neonatale muis PASMC isolaat zal voor de versterkte onderzoek van de belangrijkste signalerende wegen betrokken bij de ontwikkeling van longhypertensie en vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in dit gebied.

Protocol

De Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd dit protocol. 1. Longslagader Isolatie van neonatale muizen – Day One Bereid de complete M199 media – Mix 400 ml M199 met 100 ml (eindconcentratie = 20%) warmte geïnactiveerd FBS en 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomycine. Bereid de Serum Gratis M199 Media – Mix 500 ml M199 met 5 ml (eindconcentratie = 1%) penicilline / streptomyci…

Representative Results

Tijdens en na isolatie, zijn PASMC onderzocht zowel met lichtmicroscopie en door immunokleuring voor gladde spiercellen markers. Met lichtmicroscopie in het begin van het protocol, worden PASMC gezien migreren naar de weefselkweek schotel uit de kleine ijzeren opslagvaten (Figuur 1A). Na pooling platen een tot drie op dag dertien, dan ijzerdeeltjes zijn niet langer gezien als die zijn uitgevoerd in de laatste pooling stap getrokken. In plaats daarvan, een populatie van PASMC wordt gezien op de weefselkw…

Discussion

In dit manuscript beschrijven we voor het eerst de isolatie van PASMC van muizen op P7, P14 en P21. Om dit te bereiken, wordt een suspensie van agarose en 0,2 uM ijzerdeeltjes toegediend langs de RV in de PA. Vanwege de kleine omvang van de ijzerdeeltjes, kunnen ze niet door de pulmonale capillaire bed en zijn dus afgezet in de kleine PA. De longen worden opgeblazen, verwijderd en gescheiden. De ijzerhoudende schepen worden getrokken uit de oplossing met behulp van een magneet. Uiteindelijk worden de schepen uitgeplaat …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.