नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव
Summary
हम जिससे नवजात की चिकनी पेशी सेल संकुचन और विश्राम में शामिल संकेत दे रास्ते का बेहतर अध्ययन की अनुमति, एक उपन्यास और P7 के रूप में युवा के रूप में चूहों से फेफड़े के धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों (PASMC) को अलग करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक विकसित की है.
Abstract
पल्मोनरी हाइपरटेंशन रुग्णता और शिशुओं में मृत्यु दर का एक महत्वपूर्ण कारण है. ऐतिहासिक, भ्रूण भेड़ से PASMC में संवहनी चिकनी मांसपेशी संकुचन में शामिल संकेत दे रास्ते के महत्वपूर्ण अध्ययन किया गया है. भेड़ अवधि फेफड़े के उच्च रक्तचाप का एक शानदार मॉडल बना है, वे बहुत महंगे हैं और चूहों में पाया आनुवंशिक हेरफेर के लाभ की कमी है. इसके विपरीत, चूहों से PASMC अलग करने की अक्षमता है कि प्रणाली के एक महत्वपूर्ण सीमा थी. यहाँ हम मार्शल एट अल के पहले वर्णित तकनीक का एक परिवर्तन का उपयोग P7, P14, और p21 चूहों से माउस PASMC के प्राथमिक संस्कृतियों के अलगाव का वर्णन किया. 26 पहले से चूहा PASMC अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ये murine PASMC नवजात की अवधि में संकेत दे रास्ते के अध्ययन के लिए एक उपन्यास उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. संक्षेप में, 0.5% की एक घोल (w / v) agarose + M199 मीडिया में 0.5% लोहे के कणों सही वेंट्रिकल (आर.वी.) के माध्यम से फेफड़े संवहनी बिस्तर में संचार होता है.लोहे के कण व्यास में 0.2 माइक्रोन हैं और फेफड़े केशिका बिस्तर के माध्यम से पारित नहीं कर सकते हैं. इस प्रकार, छोटे फेफड़े धमनियों (पीए) में लोहे लॉज. फेफड़ों को हटा दिया है और अलग agarose, साथ फुलाया जाता है. लौह युक्त जहाजों एक चुंबक के साथ नीचे खींच रहे हैं. Collagenase (80 यू / एमएल) के उपचार और आगे हदबंदी के बाद, जहाजों संस्कृति पकवान पर सेल प्रवास की अनुमति के लिए 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और एंटीबायोटिक दवाओं (M199 पूरा मीडिया) युक्त M199 मीडिया में एक ऊतक संस्कृति डिश में डाल रहे हैं . कोशिकाओं के इस प्रारंभिक प्लेट fibroblasts और PASMC की एक 50-50 मिश्रण है. इस प्रकार, प्रक्रिया नीचे खींच एक अधिक शुद्ध PASMC जनसंख्या को प्राप्त करने और किसी भी अवशिष्ट लोहा निकालने के लिए कई बार दोहराया है. चिकनी पेशी सेल पहचान चिकनी पेशी मायोसिन और desmin लिए immunostaining द्वारा पुष्टि की है.
Introduction
नाल गैस विनिमय के प्रमुख अंग के रूप में कार्य करता है और हृदय उत्पादन का केवल 10% फेफड़े संवहनी बिस्तर के माध्यम से वितरित किया जाता है के बाद से पल्मोनरी हाइपरटेंशन अंतर्गर्भाशयी जीवन के दौरान सामान्य है. गर्भ में, फेफड़े के दबाव ऊंचा फेफड़े संवहनी प्रतिरोध के कारण प्रणालीगत दबावों के समान हैं . गर्भ की प्रगति, फेफड़ों के भीतर छोटे पीए का तेजी से विकास जन्म 1 पर होता है कि फेफड़े के रक्त प्रवाह में नाटकीय वृद्धि के लिए भ्रूण की तैयारी है. सामान्य प्रसवकालीन संक्रमण निकट अवधि और पूरी अवधि के शिशुओं में विफल रहता है, परिणाम (PPHN) नवजात की लगातार फेफड़े के उच्च रक्तचाप है. PPHN कई अलग अलग अंतर्निहित विकृतियों के कारण एक नैदानिक सिंड्रोम है. हालांकि, इन शिशुओं के सभी तरह के धमनी वाहीनी के रूप में या के लिए लगातार भ्रूण कनेक्शन भर में इस तरह ऊंचा फेफड़े संवहनी प्रतिरोध, hypoxemia, और रक्त प्रवाह के दाएँ से बाएँ shunting के रूप में आम pathophysiologic सुविधाओं को साझाओवेल आमीन. PPHN 1000 जीवित जन्मों प्रति 2-6 प्रभावित करता है और मृत्यु दर के रूप में भी महत्वपूर्ण अल्पकालिक और दीर्घकालिक रुग्णता 2 के एक 8-10% खतरा बता देते हैं. इसके अतिरिक्त, बहुत जन्म के समय कम वजन के समय से पहले बच्चों को उनके अंतर्निहित फेफड़ों के रोग का एक परिणाम के रूप में फेफड़े के उच्च रक्तचाप का विकास हो सकता है. समय से पहले बच्चों की सबसे आम अंतर्निहित फेफड़ों के रोग ब्रोन्कोपल्मोनरी डिस्प्लासिया (बीपीडी) है. बीपीडी की कुल जोखिम गर्भावधि उम्र और वजन जन्म के साथ संबद्ध जबकि इन शिशुओं की एक सबसेट महत्वपूर्ण पल्मोनरी हाइपरटेंशन और कैसे उचित रूप से इन शिशुओं के इलाज के लिए विकसित क्यों, यह स्पष्ट नहीं हुआ है. लंबे समय तक अस्पताल रहता है और वृद्धि की मृत्यु सहित गरीब परिणामों, 3-6 आम हैं.
ऐतिहासिक, स्वस्थ पशुओं से ovine भ्रूण PASMC या सुअर का भ्रूण PASMC जन्म के बाद सामान्य फेफड़े संवहनी संक्रमण में शामिल संकेत दे रास्ते अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये आम तौर पर एक से पांचवीं पीढ़ी के प्रतिरोध पीए से अलग कर रहे हैंएन ovine या किसी भी सहज श्वसन 7-9 से पहले वितरित और euthanized है कि सुअर का भ्रूण. इसके अतिरिक्त, कुछ जांचकर्ताओं अलग और थोड़ा पुराने से PASMC उपयोग किया और अनायास 3 दिन, 2 दिन, और 4 सप्ताह 10-12 में भेड़ के बच्चे और piglets सांस लेने की है. अभी हाल ही में कुछ समूहों को सफलतापूर्वक अलग किया और रोग राज्य 13-17 में संकेत दे रास्ते में derangements जांच करने के लिए PPHN के साथ भेड़ के बच्चे से अलग PASMC का उपयोग किया है. इन कोशिकाओं को संकेत दे रास्ते सामान्य और रोगग्रस्त निकट अवधि और अवधि फेफड़े vasculature को दोनों में महत्वपूर्ण हैं जो जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हुई है. हालांकि, वे फेफड़े के उच्च रक्तचाप के साथ समय से पहले बच्चों में प्रभावित संकेत दे रास्ते में अंतर्दृष्टि देना नहीं है. न ही वे रोग के माउस मॉडल में देखा आनुवंशिक हेरफेर की संभावनाओं की अनुमति है.
चूहा और माउस मॉडल लंबी मॉडल बीपीडी के लिए इस्तेमाल किया गया है और हाल ही में मॉडल फेफड़े लुका करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हैबीपीडी 18-22 से उत्पन्न pertension. नवजात चूहों उनके बड़े आकार के कारण के साथ काम करने के लिए मोहक हैं, लेकिन वे भी आनुवंशिक संशोधन के लिए क्षमता की कमी से पीड़ित हैं. आनुवांशिक रूप से संशोधित जानवरों को बड़े पैमाने पर नवजात चूहों में पूरे पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर विशेष जीन लक्ष्य के प्रभाव की जांच करने के लिए, लेकिन कोई भी पहले से सफलतापूर्वक इन छोटे चूहों से PASMC अलग है तिथि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. PASMC को अलग करके, अधिक से अधिक जानकारी के रास्ते में पर्यावरण उत्तेजनाओं और / या पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों में विशेष रूप से आनुवंशिक संशोधन के जवाब में बदलने के बारे में कैसे प्राप्त किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, जीना PASMC जैसे कैल्शियम और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 23-25 के रूप में महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं में तेजी से बदलाव की जांच करने के लिए वास्तविक समय में imaged किया जा सकता है. हमने हाल ही में मार्शल एट अल की तकनीक का एक परिवर्तन का उपयोग वयस्क चूहों से PASMC के सफल अलगाव का वर्णन किया. 26 चूहा PASMC 23,25,26 को अलग किया. हम अब एक ढाल लियाएन डी 7-21 दिनों उम्र के छोटे चूहों (पी 7, P14, और p21) करने के लिए इस तकनीक का विस्तार किया. इस नए PASMC अलगाव तकनीक को प्राथमिक सीमा यह प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कई चूहों की आवश्यकता है और कोशिकाओं प्राथमिक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की विशेषता है, जो बहुत धीरे धीरे बढ़ता है कि है. इन सीमाओं के बावजूद, हम नवजात माउस PASMC अलग करने के लिए इस तकनीक का फेफड़े के उच्च रक्तचाप के विकास में शामिल है और इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है कुंजी संकेत दे रास्ते की बढ़ी जांच के लिए अनुमति देगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम पहली बार P7, P14, और p21 में चूहों से PASMC के अलगाव के लिए वर्णन. यह पूरा करने के लिए, agarose और 0.2 माइक्रोन लोहे के कणों का एक घोल देहात में आर.वी. के माध्यम से संचार कर रहे हैं. लोहे के कणों के छोटे आका?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच HL109478 (KNF) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों को अलग और संस्कृति में PASMC बनाए रखने में स्वीकार करते हैं और उनकी सहायता के लिए जीना किम और Joann टेलर धन्यवाद.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
