Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern
Summary
Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.
Abstract
Aufrechterhalten homöostatischen Ca 2 +-Signal ein Grund physiologischer Prozess in lebenden Zellen. Ca 2 +-Sparks sind die elementaren Einheiten der Ca 2 +-Signalgebung in der quergestreiften Muskelfasern, die als stark lokalisierten Ca 2 +-Freisetzung Veranstaltungen von Ryanodin-Rezeptor vermittelt (RyR) Ca 2 +-Freisetzung Kanäle auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran erscheinen. Die richtige Einschätzung der Muskel Ca 2 +-Sparks könnten Auskunft über die intrazelluläre Ca 2 + Handhabungseigenschaften von gesunden und kranken quergestreiften Muskeln. Obwohl Ca 2 + Funken Ereignisse werden bei Ruhe Kardiomyozyten zu sehen, sind sie selten in Ruheskelettmuskelfasern beobachtet, somit besteht ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung und Analyse von Funken in Skelettmuskelfasern.
Detaillierte hier ist ein experimentelles Protokoll für die Messung Ca 2 +-Sparks in isolierten Beuge digitorm brevis (FDB) Muskelfasern mit fluorescent Ca 2 +-Indikatoren und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Bei diesem Ansatz, isoliert FDB Fasern, um transiente hypoosmotischen Stress, gefolgt von einer Rückkehr zu isotonischen physiologischen Lösung ausgesetzt sind. Unter diesen Bedingungen wird eine robuste Ca 2 +-Antwort Funken ist angrenzend an die Membran sarkolemmalen bei jungen gesunden FDB Muskelfasern nachgewiesen. Veränderte Ca 2 + Funken Antwort wird in dystrophischen oder im Alter von Skelettmuskelfasern nachgewiesen. Dieser Ansatz wurde kürzlich gezeigt, dass Membran-getrennte Signalisierung mit Übersprechen zwischen Inositol-(1,4,5)-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) und RyR trägt zur Ca 2 + Funke Aktivierung der Skelettmuskulatur. Zusammenfassend unsere Studien durch osmotischen Stress induzierte Ca 2 + Funken zeigten, dass diese intrazelluläre Antwort spiegelt eine Muskelsignalisierungsmechanismus in der Physiologie und Altern / Krankheitszuständen, einschließlich Mausmodellen der Muskeldystrophie (mdx-Mäusen) oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS Modell).
Introduction
Intrazellulären freien Ca 2 + ([Ca 2 +] i) ist eine vielseitige und wichtige sekundäre Messenger, der mehrere zelluläre Funktionen in erregbaren Zellen wie Neuronen, Herz-, Skelett-und glatte Muskulatur reguliert (für eine Übersicht siehe Stutzmann und Mattson 1). Geregelte Ca 2 +-Mobilisierung und Übersprechen zwischen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und T-Tubuli (TT)-Membranen sind grundlegende Regulatoren der Muskelphysiologie. Ferner können Änderungen in Ca 2 +-Signal gezeigt worden war, um eine zugrundeliegende Mechanismus des kontraktilen Dysfunktion bei verschiedenen Erkrankungen zu sein.
Ca 2 +-Sparks lokalisiert sind elementare Ca 2 +-Freisetzung Ereignisse vom Öffnen des Ryanodin-Rezeptor (RyR) Kanal auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Membran 2 stammen. Im Herzmuskel auftreten Funken spontan durch die Öffnung des RyR2-Kanal von einem Ca 2 +-induzierte Ca 2 + release (IKRK)-Mechanismus 05.03. Im Skelettmuskel wird RyR1 ausschließlich durch den Spannungssensor an der Membran TT 6,7 gesteuert. So Ca 2 + Funken werden unterdrückt und in Ruhebedingungen in intakten Skelettmuskelfasern selten erkannt. Bis vor kurzem sarkolemmalen Membran benötigt, um durch verschiedene chemische oder mechanische "Hautbildung" Methoden aufgebrochen werden, um die Unterdrückung des Spannungssensors auf RyR1 entkoppeln und Ca 2 +-Ereignisse erlaubt in Skelettmuskel 8,9 detektiert werden entfachen. Ein Verfahren zuvor beschrieben erforderlich Permeabilisierung der Membran von Muskelfasern von Saponin Reinigungsmittel 10.
Im Jahr 2003 entdeckten wir, dass entweder transient hypoosmotischen Stress oder hyperosmotischen Stress könnte peripheren induzieren Ca 2 + Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern 11. Dieses Verfahren ist seit modifiziert worden, um die molekularen Mechanismen und Modulation von Ca 2 + zu studieren </sup> Release und Dynamik 16.12. Hier beschreiben wir die Details unserer experimentellen Ansatz für Induktion, Erfassung und Analyse von Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskulatur. Wir präsentieren auch unsere maßgeschneiderten Funke-Analyse-Programm, das verwendet werden kann, um die elementaren Eigenschaften der einzelnen Ca 2 +-Sparks in der Skelettmuskulatur, z. B. Funken Frequenz und Amplitude (Δ F/F0, die die Offenwahrscheinlichkeit der RyR Kanäle spiegelt quantifizieren und die Ca 2 +-Last in der SR), die Zeit bis zum Peak (Anstiegszeit) und Dauer (FDHM, Vollzeit bei halb-maximale Amplitude) der Funken, sowie die räumliche Verteilung der Ca 2 +-Funken. Darüber hinaus präsentieren wir Beweise, die auf die verschiedenen pathophysiologischen Zuständen in der Skelettmuskulatur, wie Muskeldystrophie und amyotrophe Lateralsklerose verändert Ca 2 +-Sparks Links.
Der Vorteil dieser Technik beinhaltet die Fähigkeit, Ca 2 + in relativ unbeschädigt zu messengealterten Zellen, anstatt Strippen der Muskelfasern ermöglicht Aufnahme von Ca 2 + Funken in physiologischen Bedingungen näher. Darüber hinaus bietet unsere maßgeschneiderten Programm genauere Berechnungen der Eigenschaften des Funkens in Bezug auf die Muskelfasern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode zur Beurteilung der Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskel ist ein nützliches Werkzeug für Muskelphysiologie und Krankheitsforschung. Wir zeigten, dass die Ca 2 +-Funken Reaktion wurde unter verschiedenen Bedingungen verändert wurde, einschließlich Muskeldystrophie 11, Alterungs 18, 19, sowie in der amyotrophen Lateralsklerose 20. Unsere aktuelle Studie ergab auch, funktionelle Kopplung zwischen IP 3-Rezeptor und RyR, die ein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von RO1-AG028614 JM, RO1-AR063084to NLW und RO1-AR057404 JZ unterstützt.
Materials
| Dissecting microscope | Dissect out fibers and check muscle integrity | ||
| Dissection tools -scissors, and fine tip forceps | Fine Science Tools | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | DOW CORNING | 184 SIL ELAST KIT | Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate. |
| 60-mm glass petri dish | Pyrex | 3160 | Fiber dissection |
| Isotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Minimal Ca2+ Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| Hypotonic Tyrode Solution | Sigma-Aldrich | ||
| collagenase type I | Sigma-Aldrich | C-5138 | Fiber digestion |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluorescent Ca2+ imaging dyes |
| TMRE | Invitrogen | T669 | mitochondrial membrane potential fluorescent dyes |
| Delta TPG dishes | Bioptechs | 0420041500C | 35 mm glass bottom dish for imaging |
| Spark Fit software | data analysis software | ||
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | ||
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| temperature controllable orbital shaker | New Brunswick scientific | Fiber dissociation |
References
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