In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices
Summary
Neuroblast migrasjon er en grunnleggende hendelse i postnatal neurogenesis. Vi beskriver en protokoll for effektiv merking av neuroblasts ved in vivo postnatal elektroporering og påfølgende visualisering av deres migrasjon ved hjelp av time-lapse avbildning av akutte hjernen skiver. Vi inkluderer en beskrivelse for kvantitativ analyse av neuroblast dynamikk av video sporing.
Abstract
Subventricular sone (SVZ) er en av de viktigste nevrogene nisjer i barsel hjernen. Her, nevrale stamceller spre seg og gi opphav til neuroblasts stand til å bevege seg langs rostral migrasjonsstrømmen (RMS) mot luktelappen (OB). Dette langdistanse migrasjon er nødvendig for etterfølgende modning av nyfødte nerveceller i OB, men de molekylære mekanismene som regulerer denne prosessen er fortsatt uklart. Gransker signalveier kontrollerende neuroblast motilitet kan ikke bare bidra til å forstå en grunnleggende trinn i neurogenesis, men også ha terapeutisk regenerativ potensial, får muligheten til disse neuroblasts å målrette hjernen områder rammet av skader, hjerneslag, eller degenerasjon.
I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert protokoll for in vivo postnatal elektroporering og påfølgende time-lapse avbildning av neuroblast migrasjon i muse RMS. Postnatal elektroporering kan effektivt transfektere SVZ stamfarceller, som i sin tur genererer neuroblasts migrere langs RMS. Bruke konfokalmikroskoper spinne disk time-lapse mikroskopi på akutte hjerne skive kulturer, kan neuroblast migrasjon overvåkes i et miljø tett ligner in vivo tilstand. Videre kan neuroblast motilitet spores og kvantitativt analysert. Som et eksempel, beskriver vi hvordan du bruker in vivo postnatal elektroporering av en GFP-uttrykke plasmid å merke og visualisere neuroblasts trekkende langs RMS. Electroporation av shRNA eller CRE rekombinase-uttrykke plasmider i betingede knockout mus som anvender LoxP systemet kan også brukes til å målrette gener av interesse. Farmakologisk manipulering av akutte hjernen skive kulturer kan utføres for å undersøke hvilken rolle ulike signalmolekyler i neuroblast migrasjon. Ved kopling in vivo electroporation med time-lapse bildebehandling, håper vi å forstå de molekylære mekanismene som styrer neuroblast motilitet og bidra til å utvikleling av nye tilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.
Introduction
I pattedyrhjernen, oppstår generering av nye nerveceller (neurogenesis) etter fødselen hovedsakelig i to regioner, subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene og subgranular sone i dentate gyrus av hippocampus en. Betydelig bevis samlet i de siste årene støtter en avgjørende rolle for postnatal neurogenesis i hippocampus og luktelappen minnefunksjoner 1-3. Viktigere, har postnatal neurogenesis også terapeutisk potensial på grunn av sitt forhold til degenerative nevrologiske lidelser, og evnen til neuroblasts å migrere til skadde områder i hjernen 4-6.
Subventricular sone (SVZ) har nylig dukket opp som en avgjørende nevrogen nisje. SVZ-avledet neuroblasts migrere mot luktelappen (OB) via rostral migrasjonsstrømmen (RMS), noe som gjør dette den lengste migreringsprosessen i postnatal hjernen 1,7,8. Pattedyr SVZ / RMS / OB-systemet har blitt ennyttig modell for å studere forskjellige trinnene i neurogenesis, for eksempel proliferasjon, migrering og differensiering 1,8. Mange vekstfaktorer og ekstracellulære signaler regulerer SVZ neurogenesis og migrasjon langs RMS, men den intracellulære molekylære mekanismene er langt fra å være fullt ut forstått 1,9. Riktig migrasjon langs RMS er avgjørende for den videre modning av nyfødte nerveceller 10. I tillegg har noen studier vist at SVZ-avledet neuroblasts kan migrere ut av RMS til hjerneskade sider 4-6,11-13. Således undersøkte signalmekanismer regulerings neuroblast migrasjon er grunnleggende ikke bare å forstå neurogenesis men også for potensielle terapeutiske applikasjoner.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å merke SVZ nevrale stamceller ved in vivo postnatal elektroporering og overvåke deres migrasjon langs RMS i akutte hjernen skive kulturer ved hjelp av time-lapse roterende disk confocal mikroskoppy. Electroporation er mye brukt i utviklingsstudier fra embryonale til voksne stadier 14-18. Det er et kraftig verktøy for å målrette og manipulere SVZ nevrale stamceller og representerer et billigere og betydelig raskere alternativ til stereotaktisk injeksjon av virale vektorer eller generering av transgene modeller 1,15,19,20. Det er en relativt enkel fremgangsmåte som ikke krever kirurgi, og har høy overlevelse. Electroporation av shRNA eller CRE rekombinase-uttrykke plasmider i muse genetiske modeller anvender LoxP systemet kan brukes til å målrette gener av interesse eller for å oppnå permanent merking av SVZ stamfedre, og dermed representerer et nyttig verktøy for voksne neurogenesis studier 21,22.
Imaging RMS neuroblast migrasjon i intakt hjernen er fortsatt utfordrende på grunn av tekniske begrensinger. Imidlertid kan denne prosessen overvåkes ved hjelp confocal roterende disk time-lapse mikroskopi av akutte hjernen skiver, som gir en passende system tett ligner in vivo tilstanden også mottagelig for farmakologisk manipulasjon 23,24. Coupling in vivo postnatal elektroporering med time-lapse bildebehandling vil lette forståelsen av de molekylære mekanismer som styrer neuroblast motilitet og bidra til utvikling av nye tilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv migrasjon av nevrale stamceller langs RMS sikrer deres påfølgende modning i funksjonelle nerveceller 10. Prominent strømmer av nevrale stamceller rettet mot OB er synlige i menneskets barndom og vil trolig spille en viktig rolle i tidlig postnatal menneskelige hjernens utvikling 27. Dessuten, disse celler er i stand til å målrette områder av hjernen som påvirkes av skade og neurodegenerering 4,28. Å kunne overvåke i sanntid effekten av genmanipulering på neuroblast dyn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS og YZ støttes av KCL og KCL-Kina Doktorgradsstipend. MO ble finansiert av en Bioteknologi og Biological Sciences Research Council PhD student. Vi takker Masaru Okabe og Jun-ichi Miyazaki for PCX-EGFP plasmid og Alain Chedotal og Athena Ypsilanti for verdifulle råd om elektroporering.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neurosciences. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
