في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح
Summary
الهجرة أرومة عصبية هو حدث أساسي في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. نحن تصف البروتوكول لوضع العلامات كفاءة neuroblasts من قبل في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والتصور لاحقة من هجرتهم باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير من شرائح الدماغ الحادة. نحن وتشمل وصفا للتحليل الكمي لديناميات أرومة عصبية من خلال تتبع الفيديو.
Abstract
منطقة subventricular (SVZ) هي واحدة من المنافذ الرئيسية العصبية في الدماغ بعد الولادة. هنا، الأسلاف العصبية تتكاثر وتؤدي إلى neuroblasts قادرة على التحرك على طول تيار المهاجرة منقاري (RMS) نحو البصلة الشمية (OB). مطلوب هذه الهجرة لمسافات طويلة للنضوج اللاحقة من الخلايا العصبية في الأطفال حديثي الولادة OB، ولكن الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية لا تزال غير واضحة. التحقيق في مسارات إشارات التحكم أرومة عصبية حركية قد تساعد ليس فقط على فهم خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية، ولكن أيضا لديها القدرة على التجدد العلاجية، نظرا لقدرة هذه neuroblasts لاستهداف مواقع الدماغ التي تأثرت الإصابة، السكتة الدماغية، أو الضمور.
في هذا المخطوط وصفنا بروتوكول مفصلة لفي الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي واللاحقة الوقت الفاصل بين التصوير الهجرة أرومة عصبية في RMS الماوس. التثقيب الكهربائي بعد الولادة يمكن بالنقل بكفاءة SVZ السلفالخلايا، والتي تولد بدورها neuroblasts المهاجرة على طول RMS. باستخدام متحد البؤر الغزل القرص الوقت الفاصل بين المجهري على الحادة الثقافات شريحة الدماغ، والهجرة أرومة عصبية يمكن رصدها في بيئة تشبه إلى حد كبير حالة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يمكن تتبع أرومة عصبية حركية وتحليلها كميا. كمثال على ذلك، ونحن تصف كيفية استخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة من البلازميد، معربا عن GFP لتسمية وتصور neuroblasts المهاجرة على طول RMS. ويمكن أيضا التثقيب الكهربائي من shRNA أو لجنة المساواة العرقية البلازميدات، معربا عن recombinase في الفئران خروج المغلوب الشرطي توظيف نظام LoxP أن تستخدم لاستهداف الجينات في المصالح. التلاعب الدوائي الحاد الثقافات شريحة الدماغ يمكن إجراء للتحقيق في دور جزيئات إشارات مختلفة في الهجرة أرومة عصبية. وذلك بربط في الجسم الحي electroporation مع الوقت الفاصل بين التصوير، ونحن نأمل أن فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في أرومة عصبية حركية والمساهمة في تطويرمنة رواية النهج لتعزيز إصلاح الدماغ.
Introduction
في أدمغة الثدييات، وتوليد خلايا عصبية جديدة (تكوين الخلايا العصبية) تحدث بعد الولادة بشكل رئيسي في منطقتين، منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب في التلفيف المسنن من الحصين 1. أدلة كثيرة جمعت في السنوات الأخيرة تدعم دورا حاسما لتكوين الخلايا العصبية بعد الولادة في وظائف الذاكرة وحاسة الشم لمبة الحصين 1-3. الأهم من ذلك، تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة يحمل أيضا الإمكانات العلاجية بسبب علاقته مع الاضطرابات العصبية التنكسية، وقدرة neuroblasts إلى الهجرة إلى المواقع المصابة في الدماغ 4-6.
وقد برزت منطقة subventricular (SVZ) مؤخرا في مكانة العصبية حاسمة. neuroblasts SVZ المستمدة من الهجرة نحو البصلة الشمية (OB) عبر تيار المهاجرة منقاري (RMS)، مما يجعل هذه العملية أطول الهجرة في 1،7،8 الدماغ بعد الولادة. أصبح SVZ / RMS / نظام OB الثدييات ونموذجا مفيدا لدراسة الخطوات المختلفة في تكوين الخلايا العصبية، مثل الانتشار والهجرة والتمايز 1،8. العديد من عوامل النمو والعظة خارج الخلية تنظيم الخلايا العصبية SVZ والهجرة على طول RMS، ولكن الآليات الجزيئية داخل الخلايا هي أبعد من أن تكون مفهومة تماما 1،9. الهجرة السليم على طول RMS هو أمر حاسم لنضوج الخلايا العصبية اللاحقة من الأطفال حديثي الولادة 10. بالإضافة إلى ذلك، فقد أظهرت بعض الدراسات أن neuroblasts SVZ مشتقة يمكن ترحيل من RMS إلى مواقع إصابات الدماغ 4-6،11-13. وبالتالي، والتحقيق في آليات تنظيم الإشارات أرومة عصبية الهجرة أمر أساسي ليس فقط لفهم تكوين الخلايا العصبية ولكن أيضا للتطبيقات العلاجية المحتملة.
هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لتسمية الأسلاف العصبية SVZ من قبل في electroporation فيفو بعد الولادة ومراقبة الهجرة على طول RMS في الحادة الثقافات شريحة الدماغ باستخدام الوقت الفاصل بين متحد البؤر القرص الغزل microscoPY. ويستخدم على نطاق واسع في الدراسات التنموية التثقيب الكهربائي من المراحل الجنينية لالكبار 14-18. بل هو أداة قوية لاستهداف والتلاعب الأسلاف العصبية SVZ وتمثل بديلا أرخص وأسرع بكثير لحقن المجسم من ناقلات فيروسية أو جيل من النماذج المعدلة وراثيا 1،15،19،20. وهو إجراء بسيط نسبيا، والتي لا تحتاج لعملية جراحية ولديه معدلات البقاء على قيد الحياة عالية. التثقيب الكهربائي من shRNA أو لجنة المساواة العرقية البلازميدات، معربا عن recombinase في نماذج الماوس الوراثية توظيف نظام LoxP يمكن استخدامها لاستهداف الجينات في المصالح أو لتحقيق وضع العلامات الدائمة من الأسلاف SVZ، وبالتالي يمثل أداة مفيدة لدراسات تكوين الخلايا العصبية الكبار 21،22.
التصوير RMS أرومة عصبية الهجرة في الدماغ سليمة لا يزال تحديا بسبب القيود التقنية الحالية. ومع ذلك، يمكن رصد هذه العملية باستخدام القرص متحد البؤر الغزل الوقت الفاصل بين المجهري لشرائح الدماغ الحادة، والتي توفر SYST مناسبةم تشبه إلى حد كبير حالة في الجسم الحي قابلة أيضا للتلاعب الدوائية 23،24. سوف اقتران التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة مع الوقت الفاصل بين التصوير تسهيل فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في أرومة عصبية حركية والمساهمة في وضع نهج جديدة لتعزيز إصلاح الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة كفاءة من الأسلاف العصبية على طول RMS يضمن النضج في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية الوظيفية 10. تيارات بارزة من الأسلاف العصبية الموجهة نحو OB واضحة في مرحلة الطفولة البشرية ويرجح أن تلعب دورا هاما في وقت مبكر بعد الولادة تطور الدماغ البشري 27. وعلاوة على ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمدة من قبل MS وYZ بوكل بوكل والصين دراسية لدرجة الدكتوراة. وقد تم تمويل MO بواسطة التكنولوجيا الحيوية والدكتوراه مجلس بحوث العلوم البيولوجية studentship. نشكر ماسارو أوكابي ويونيو إشي ميازاكي لالبلازميد PCX-EGFP وآلان Chedotal وأثينا إبسيلانتي للحصول على المشورة قيمة عن التثقيب الكهربائي.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neurosciences. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
