In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver
Summary
Neuroblast migration er en grundlæggende begivenhed i postnatal neurogenesis. Vi beskriver en protokol til effektiv mærkning af neuroblasts ved in vivo postnatal elektroporation og efterfølgende visualisering af deres migration ved hjælp af time-lapse billeddannelse af akutte hjernen skiver. Vi inkluderer en beskrivelse af den kvantitative analyse af neuroblast dynamik ved video tracking.
Abstract
Den subventricular zone (SVZ) er en af de vigtigste neurogene nicher i den postnatale hjerne. Her neurale progenitorceller formere sig og give anledning til neuroblaster i stand til at bevæge sig langs rostralt vandrende strøm (RMS) mod lugtekolben (OB). Denne lange afstande migration er nødvendig for den efterfølgende modning af nyfødte neuroner i OB, men de molekylære mekanismer, der regulerer denne proces er stadig uklart. Undersøge signalveje, der kontrollerer neuroblast motilitet ikke blot kan hjælpe med at forstå et grundlæggende skridt i neurogenese, men også have terapeutisk regenerative potentiale, da evnen af disse neuroblasts at målrette hjernen ramt af skader, slagtilfælde eller degeneration.
I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol for in vivo postnatal elektroporation og efterfølgende time-lapse billeddannelse af neuroblast migration i mus RMS. Fødselsdepression elektroporation kan effektivt transficere SVZ stamfaderceller, som igen genererer neuroblaster migrerer langs RMS. Brug konfokal spinning disk time-lapse mikroskopi om akutte hjerne skivekulturer kan neuroblast migration skal overvåges i et miljø, der ligner in vivo tilstand. Desuden kan neuroblast motilitet spores og analyseres kvantitativt. Som et eksempel beskriver vi, hvordan du bruger in vivo postnatal elektroporation af en GFP-udtrykkende plasmid til at mærke og visualisere neuroblasts migrerer langs RMS. Elektroporering af shRNA eller CRE recombinase-udtrykkende plasmider i betingede knockout mus med den LoxP Systemet kan også anvendes til at målrette gener af interesse. Farmakologisk manipulation af akut hjerne skivekulturer kan udføres for at undersøge den rolle, som forskellige signalmolekyler i neuroblast migration. Ved at koble in vivo elektroporation med time-lapse imaging, håber vi at forstå de molekylære mekanismer, der styrer neuroblast motilitet og bidrage til at udvikleling af nye tilgange til at fremme hjernens reparation.
Introduction
I pattedyrs hjerne optræder dannelsen af nye neuroner (neurogenese) efter fødslen hovedsageligt to områder, den subventrikulære zone (SVZ) af de laterale ventrikler og subgranular zone i den tandede gyrus af hippocampus 1. Betydelige beviser indsamlet i de seneste år understøtter en afgørende rolle for postnatal neurogenese i hippocampus og olfaktoriske pære hukommelsesfunktioner 1-3. Vigtigere er det, postnatal neurogenese rummer også terapeutiske potentiale på grund af sit forhold med degenerative neurologiske lidelser, og evne til neuroblasts at migrere til skadelidte steder i hjernen 4-6.
Den subventricular zone (SVZ) har for nylig vist sig som en afgørende neurogen niche. SVZ-afledte neuroblasts migrere til lugtekolben (OB) via rostralt vandrende strøm (RMS), hvilket gør dette den længste migration proces i postnatal hjerne 1,7,8. Pattedyrs SVZ / RMS / OB system er blevet ennyttig model til at studere forskellige trin i neurogenese, såsom proliferation, migrering og differentiering 1,8. Mange vækstfaktorer og ekstracellulære signaler regulerer SVZ neurogenesis og migration langs RMS, men de intracellulære molekylære mekanismer er langt fra at være fuldt forstået 1,9. Korrekt migration langs RMS er afgørende for den efterfølgende modning af nyfødte neuroner 10. Derudover har nogle undersøgelser vist, at SVZ-afledte neuroblasts kan migrere ud af RMS til hjerneskade sites 4-6,11-13. Således undersøger signalering mekanismer, der regulerer neuroblast migration er grundlæggende ikke blot at forstå neurogenesis, men også for potentielle terapeutiske anvendelser.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at mærke SVZ neurale progenitorer ved in vivo postnatal elektroporation og overvåge deres vandring langs RMS i akutte hjerne skivekulturer bruge time-lapse spinning disk konfokal microscopy. Elektroporation er meget udbredt i udviklingsmæssige undersøgelser fra embryonale til voksne stadier 14-18. Det er et kraftfuldt værktøj til at målrette og manipulere SVZ neurale stamfædre og repræsenterer en billigere og betydeligt hurtigere alternativ til stereotaktisk injektion af virale vektorer eller generering af transgene modeller 1,15,19,20. Det er en relativt enkel procedure, som ikke behøver operation, og har høje overlevelsesrater. Elektroporation af shRNA eller CRE recombinase-udtrykkende plasmider i mus genetiske modeller, der anvender LoxP systemet kan bruges til at målrette gener af interesse eller for at opnå permanent mærkning af SVZ stamceller repræsenterer således et nyttigt redskab for voksne neurogenese studier 21,22.
Imaging RMS neuroblast migration i den intakte hjerne er stadig udfordrende på grund af de nuværende tekniske begrænsninger. Dog kan denne proces overvåges ved hjælp af konfokal spinning disk time-lapse mikroskopi af akutte hjernen skiver, som giver en passende system ligner in vivo tilstand også modtagelig for farmakologisk manipulation 23,24. Kobling in vivo postnatal elektroporation med time-lapse imaging vil lette forståelsen af de molekylære mekanismer, der styrer neuroblast motilitet og bidrage til udviklingen af nye metoder til fremme hjernens reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv migration af neurale stamfædre langs RMS sikrer deres efterfølgende modning i funktionelle neuroner 10. Fremtrædende strømme af neurale forfædre rettet mod OB er synlige i menneskets barndom og er tilbøjelige til at spille en vigtig rolle i den tidlige postnatale udvikling menneskelige hjerne 27. Desuden er disse celler i stand til målsteder af hjernen påvirkes af skade og neurodegeneration 4,28. At være i stand til at overvåge i realtid effekten af genmanipulati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS og YZ understøttes af KCL og KCL Kina ph.d.-stipendier. MO blev finansieret af en bioteknologi og biologiske Sciences Research Council Ph.d. studentship. Vi takker Masaru Okabe og Jun-ichi Miyazaki til PCX-EGFP plasmid og Alain Chedotal og Athena Ypsilanti for værdifuld rådgivning om elektroporation.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neurosciences. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
