Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.
Les cellules incorporées dans les gels de collagène et de fibrine se fixent et exercent des forces de traction sur les fibres du gel. Ces forces peuvent conduire à une réorganisation locale et mondiale et à un réalignement de la microstructure du gel. Ce processus se déroule d’une manière complexe qui dépend en partie de l’interaction entre l’emplacement des cellules, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel. Pour mieux comprendre comment ces variables produisent des modèles globaux d’alignement des fibres, nous utilisons la microscopie de contraste différentiel d’interférence (DIC) time-lapse couplée à un bioréacteur contrôlé par l’environnement pour observer le processus de compactage entre les explants géométriquement espacés (amas de fibroblastes). Les images sont ensuite analysées avec un algorithme de traitement d’image personnalisé pour obtenir des cartes de la souche. Les informations obtenues à partir de cette technique peuvent être utilisées pour sonder la mécanobiologie de diverses interactions cellule-matrice, ce qui a des implications importantes pour comprendre les processus de cicatrisation des plaies, le développement de maladies et les applications d’ingénierie tissulaire.
Un outil important pour étudier les interactions cellule-matrice est le gel de collagène peuplé de cellules1,2. Le gel fournit un environnement 3D plus proche du caractère in vivo du tissu et mieux adapté à la compréhension du comportement cellulaire que ne le proposent les cultures 2D traditionnelles3. Les premières études dans lesquelles les fibroblastes ont été distribués de manière homogène dans un gel de collagène ont révélé que les cellules consolident rapidement les fibres de collagène et compactent le gel4,5. Les fibroblastes contractiles en gels flottants passent alors à un état de repos peu après que le gel a complètement atteint le compactage1,6,7. Les fibroblastes en gels qui sont contraints aux limites restent dans un état actif et synthétique8 et ils génèrent un alignement des fibres d’une manière dépendante de la géométrie du gel et des contraintes externes5,9. Les différences dans l’activité cellulaire semblent être le résultat de la tension interne (ou de l’absence de tension interne) qui se développe à mesure que les cellules exercent des forces de traction via des intégrines sur les fibres de collagène dans le gel.
Une variante de cette technique consiste à placer des explants de fibroblastes(c’est-à-dire des amas de cellules) à une distance l’un de l’autre au sein d’un gel de collagène et à observer les interactions cellule-matrice et le développement progressif de l’alignement des fibres entre les explants (parfois appelés sangles en forme de ligament)10-12. Le principal avantage du système explant est qu’il permet d’organiser les cellules en motifs géométriques simples, ce qui facilite la visualisation et le sondage des mécanismes sous-jacents au réalignement cellulaire des fibres. Ces modèles d’alignement — qui dépendent principalement de l’interaction entre les forces de traction cellulaire, la distribution spatiale cellulaire, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel — sont importants à comprendre car ils jouent un rôle central dans l’organisation tissulaire globale, la fonction mécanique et l’environnement mécanique local13.
Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, une stratégie pour produire des tissus mécaniquement fonctionnels et modifiés consiste à contrôler le modèle d’alignement des fibres qui se développe à partir du compactage cellulaire afin que le tissu modifié possède un alignement des fibres qui imite celui du tissu natif14,15. Un tel alignement est considéré nécessaire pour que les tissus modifiés reproduisent le comportement mécanique complexe des tissus natifs. Une modification de cette stratégie consiste à remplacer le gel de collagène par un gel de fibrine16. Le gel de fibrine développe un modèle d’alignement similaire à celui d’un gel de collagène pendant le compactage. Au fil du temps la fibrine est dégradée et remplacée par l’ECM cellule-synthétisé qui suit le modèle initial d’alignement de fibre de fibrine. La construction d’ingénierie résultante a considérablement amélioré les propriétés mécaniques par rapport aux constructions dérivées de gel de collagène17.
Le processus d’alignement et les événements de remodelage ultérieurs dans les gels de fibrine se déroulent d’une manière compliquée et mal comprise. Pour mieux caractériser ces interactions et leur effet sur le comportement cellulaire et le remodelage ECM, nous avons développé une procédure basée sur la méthode explant. Dans cette méthode, les explants de fibroblastes sont positionnés sur un gel de fibrine dans différents motifs géométriques. Les gels sont maintenus dans un bioréacteur18contrôlé par l’environnement et monté au microscope, et le processus de compactage et de réalignement des fibres est surveillé avec une microscopie à contraste d’interférence différentiel (DIC) en accéléré. Les champs de déplacement sont quantifiés à l’avec des algorithmes personnalisés. Les données obtenues à partir de ces expériences ont des implications variées pour un certain nombre de processus, y compris l’optimisation des stratégies d’ingénierie tissulaire, l’amélioration de la cicatrisation des plaies et le traitement du remodelage pathologique des tissus.
Ce protocole a été développé dans le but d’observer et de quantifier la mécanique impliquée dans le remodelage de l’ECM à médiation cellulaire. De tels processus sous-tendent un certain nombre de phénomènes biologiques et ont des implications importantes pour l’ingénierie des tissus2,22, la réduction de la cicatrice1,23, et la compréhension du remodelage tissulaire pathologique12,24. L’utilisation de la microscopie DIC time-lapse permet de résoudre et de quantifier l…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions George Giudice et Steven Eliason d’avoir fait don de fibroblastes cutanés humains et Ramesh Raghupathy pour l’aide avec l’algorithme de suivi des souches. Le soutien à ce travail a été fourni par une bourse d’aide aux diplômés du département de l’Éducation des États-Unis dans les domaines de besoin national (GAANN P200A120071).
Sigma-Aldrich | F8630 | |
Sigma-Aldrich | T4648 | |
Gibco | 11965-092 | |
Gibco | 15140-122 | |
Sigma-Aldrich | A2942 | |
Sigma-Aldrich | H0887 | |
Sigma-Aldrich | 223506 | |
Gibco | 25200-056 | |
Invitrogen | 3000 | |
Lonza | DE14-701F | |
Molecular Probes | F8858 | |
GIBCO | A10483-01 | |
GIBCO | 11430-030 | |
Fisher-Scientific | SS264-1 | |
Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
Biotense Bioreactor | ADMET | |
Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |