Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d'épithélium de la vessie
Summary
Nous avons développé un modèle in vitro qui imite un élément important de la réponse inflammatoire aiguë lors d'une infection de la vessie avec Escherichia coli uropathogènes. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet une évaluation quantitative de la migration des neutrophiles humains à travers l'épithélium de la vessie, cultivées sur des supports perméables, en réponse à une infection bactérienne ou substances chimiotactiques.
Abstract
Le recrutement de cellules immunitaires de la périphérie vers le site de l'inflammation est une étape essentielle dans la réponse immunitaire innée à n'importe quelle surface de la muqueuse. Au cours de l'infection de la vessie, les leucocytes polymorphonucléaires (PMN; neutrophiles) migrent de la circulation sanguine et traversent l'épithélium de la vessie. L'incapacité à résoudre l'infection en l'absence d'une réponse neutrophile démontre l'importance de PMN dans la défense de la vessie. Afin de faciliter la colonisation de l'épithélium de la vessie, uropathogène d'Escherichia coli (UPEC), l'agent causal de la majorité des infections du tractus urinaire (ITU), atténuer la réponse inflammatoire aiguë en utilisant une variété de mécanismes partiellement définies. Pour approfondir l'interaction entre l'hôte et l'agent pathogène bactérien, nous avons développé un modèle in vitro de cet aspect de la réponse immunitaire innée à l'UPEC. Dans le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial, une variante de la chambre de Boyden, en culture vessie epithElial cellules sont cultivées jusqu'à confluence sur la face inférieure d'un support perméable. PMN sont isolés à partir de sang veineux humain, et sont appliquées sur le côté basolatéral des couches de cellules épithéliales de la vessie. Migration des PMN représentant la direction basolatérale à apicale physiologiquement pertinents en réponse à une infection bactérienne ou molécules chimiotactiques est énumérée en utilisant un hématimètre. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les interactions entre les cellules eucaryotes et UPEC ainsi que pour interroger les exigences moléculaires pour la traversée de l'épithélium de la vessie par les PMN. Le modèle de la migration des neutrophiles transuroepithelial fera progresser notre compréhension de la réponse inflammatoire initiale à l'UPEC dans la vessie.
Introduction
Le mouvement des cellules dans tout le corps, souvent sur de longues distances, est nécessaire pour la croissance et le développement, la cicatrisation des plaies, et la réponse immunitaire. La migration cellulaire est complexe et nécessite la coordination de nombreux processus différents, y compris les cascades de signalisation et le réarrangement des composants du cytosquelette. Les cellules peuvent se déplacer de façon aléatoire (chimiokinèse) ainsi que vers des gradients chimiques définies (chimiotaxie). De nombreuses techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire in vitro. La technique la plus ancienne et la plus commune, la chambre de Boyden, se compose d'un système vertical à deux compartiments où une substance chimiotactique est placé dans la chambre et les cellules d'intérêt bas sont placés dans la chambre supérieure 1. La circulation des cellules à travers le filtre perméable, avec des pores d'une taille définie, séparant les deux chambres est surveillée. D'autres techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire, y compris la chambre Zigmond 2 et la chambre Dunn3. Ces approches collectives ont donné un aperçu significatif dans le mouvement de nombreux types de cellules différents.
En plus d'interroger les principes de base de la chimiokinèse et la chimiotaxie, des dosages à deux chambres ont facilité l'étude de la migration des cellules à travers les composants de la matrice extracellulaire et les deux couches de cellules endothéliales et épithéliales. Un avantage des systèmes à deux chambres par rapport aux autres techniques est que la membrane poreuse peut être revêtu avec des protéines telles que le collagène ou le fibrinogène, et la migration cellulaire à travers une barrière de la matrice extracellulaire analogue peut être évaluée. En outre, les lignées cellulaires cultivées peuvent être cultivées et différenciées sur les supports perméables. Pour étudier le mouvement des cellules à travers une barrière endothéliale, les cellules endothéliales en culture sont ensemencées et cultivées dans le réservoir supérieur des supports perméables. Cellules mobiles, tels que les cellules du système immunitaire, sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration dans le réservoir inférieur à travers la sallebarrière endothéliale dans le sens physiologique apicale à basolatérale est observée. Ce modèle a été inestimable dans la compréhension de l'extravasation des cellules immunitaires de la circulation sanguine. A la différence de la migration trans-endothéliale, la circulation des cellules à travers une barrière épithéliale se produit généralement dans le sens basolatéral à apical. Afin de modéliser ces événements in vitro, les chercheurs semences et la croissance des cellules épithéliales cultivées sur la face inférieure des supports perméables. Cellules mobiles sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration à travers la barrière epitheliale, qui représente le sens basolatéral à apical, est surveillée. Ces modèles de migration trans-épithéliale ont contribué de manière significative à notre compréhension des réactions inflammatoires au niveau des surfaces muqueuses, en particulier ceux du poumon et l'intestin 4,5.
En revanche, le trafic des cellules immunitaires à travers l'épithélium du tractus urinaire a reçu beaucoup moins d'attention. Pour approfondir notre understanding des réponses immunitaires innées dans les voies urinaires pendant l'infection avec uropathogène Escherichia coli (UPEC), nous avons développé un test in vitro, le test de la migration des neutrophiles transuroepithelial, qui permet l'étude des leucocytes polynucléaires (PMN; neutrophiles) mouvement à travers une barrière vessie épithéliale 6 -8. Comme avec d'autres modèles à deux chambres de migration trans-épithéliale, des cellules humaines cultivées de la vessie épithéliales sont cultivées sur la face inférieure d'un support perméable et forment des couches epitheliales confluentes. Les neutrophiles humains, isolés à partir de sang veineux, sont appliquées sur le côté basolatéral de la couche epitheliale, et la migration à travers l'épithélium dans le sens basolatéral à apical physiologiquement pertinent est quantifiée en réponse à l'infection par différentes souches de E. coli ou de la présence de molécules chimiotactiques. De nombreuses recherches ont porté sur le mouvement des neutrophiles, à la fois la chimiokinèse et la chimiotaxie, en l'absence de types de cellules additionnelles. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial est avantageuse car elle prend en compte les interactions complexes entre les cellules épithéliales de la vessie et les cellules du système immunitaire lors de l'infection. Cette docile modèle in vitro a le potentiel de permettre la vérification détaillée de la réponse immunitaire au niveau des surfaces uroépithéliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant une lignée de cellules épithéliales de la vessie de culture et fraîchement isolé PMN humain, nous avons établi un modèle in vitro de migration des neutrophiles transuroepithelial. Ce modèle a contribué à commencer à disséquer la complexité de la réponse immunitaire innée lors de l'infection des voies urinaires (UTI), une infection bactérienne très commune généralement causée par UPEC 9. Au cours de l'infection de la vessie, ou la cystite, le recrutement de PMN…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01-DK080752 et P50-DK064540. Nous remercions J. Loughman pour ses efforts dans l'établissement de ce test.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
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