Kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over en Kulturperler Blære epitel
Summary
Vi har udviklet en in vitro-model, der efterligner en vigtig komponent i den akutte inflammatoriske respons under infektion af blæren med uropatogen Escherichia coli. Den transuroepithelial neutrofil migration assay muliggør kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over blæren epitel, dyrket på permeable understøtninger, som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende stoffer.
Abstract
Rekrutteringen af immunceller fra periferien til stedet for inflammation er et vigtigt skridt i indsatsen på enhver slimhindeoverflade medfødte immunforsvar. Under infektion af urinblæren, polymorfkernede leukocytter (PMN; neutrofiler) migrere fra blodbanen og krydse blæren epitel. Manglende løse infektion i fravær af en neutrofile respons viser betydningen af PMN i blæren forsvar. For at lette kolonisering af blæren epitel, uropatogen Escherichia coli (UPEC), det kausative middel for hovedparten af urinvejsinfektioner (UVI), dæmpe akut inflammatorisk reaktion ved hjælp af en række delvist definerede mekanismer. For yderligere at undersøge samspillet mellem vært og bakterielt patogen, udviklede vi en in vitro model for dette aspekt af reaktionen på UPEC medfødte immunreaktion. I transuroepithelial neutrofilmigration assay, en variation på Boydenkammer, kulturperler blære epithelial Cellerne dyrkes til konfluens på undersiden af en permeabel støtte. PMN isoleres fra humant veneblod og er anbragt på den basolaterale side af blæren epitelcelle lag. PMN migration repræsenterer fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning som reaktion på bakteriel infektion eller kemotiltrækkende molekyler optælles ved hjælp af et hæmocytometer. Denne model kan anvendes til at undersøge interaktionen mellem UPEC og eukaryote celler, såvel som at forespørge de molekylære krav til traversal blære epithel af PMN. Den transuroepithelial neutrofilmigration model vil fremme vores forståelse af den oprindelige inflammatoriske respons på UPEC i blæren.
Introduction
Bevægelsen af celler i hele kroppen, ofte over store afstande, der kræves for vækst og udvikling, sårheling og immunrespons. Cellemigrering er kompleks og kræver koordinering af mange forskellige processer, herunder signaleringskaskader og omlejring af cytoskeletale komponenter. Celler kan bevæge sig tilfældigt (kemokinese) samt mod definerede kemiske gradienter (chemotaxis). Mange teknikker er blevet udviklet til at studere celle-migration in vitro. Den ældste og mest almindelige teknik, den Boydenkammer, består af en lodret to-kammer-system, hvor en chemoattractant Stoffet anbringes i den nederste kammer og celler af interesse er placeret i den øverste kammer 1.. Overvåges Bevægelsen af celler på tværs af gennemtrængelige filter med porer med defineret størrelse, der adskiller de to kamre. Yderligere teknikker er blevet udviklet for at undersøge cellemigration herunder Zigmond kammeret 2 og Dunn kammer3. Disse kollektive tilgange har givet betydelig indsigt i bevægelsen af mange forskellige celletyper.
Ud over at udspørgende de grundlæggende principper for kemokinese og kemotaxi, har to-kammer assays lettet undersøgelsen af cellemigrering gennem ekstracellulære matrixkomponenter og både endotelceller og epitelceller lag. En fordel ved to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker er, at den porøse membran kan overtrækkes med proteiner, såsom collagen eller fibrinogen, og cellemigration over en ekstracellulær matrix-lignende barriere kan vurderes. Derudover kan dyrkede cellelinier dyrkes og differentieres på de gennemtrængelige understøtninger. For at undersøge bevægelsen af celler på tværs af en endotel barriere er dyrkede endotelceller podes og dyrkes i det øvre reservoir af gennemtrængelige understøtninger. Motile celler, såsom immunceller, tilsættes til den øvre reservoir og migration ind i det nedre reservoir over enobserveres dothelial barriere i fysiologisk apikal-til-basolateral retning. Denne model har været uvurderlig i forståelsen ekstravasation af immunceller ud af blodet. I modsætning til transendothelial migration, forekommer typisk flytning af celler på tværs af en epitelbarriere i den basolaterale-til-apikal retning. For at modellere disse begivenheder in vitro forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden af de gennemtrængelige understøtninger. Motile celler tilsættes til det øvre reservoir og migration over epitelbarrieren, repræsenterer den basolaterale-til-apikale retning, overvåges. Sådanne modeller af transepithelial migration har bidraget betydeligt til vores forståelse af inflammatoriske reaktioner på slimhindeoverflader, især i lungerne og gut 4,5.
I modsætning hertil har immuncelle handel gennem epitel urinvejene fået meget mindre opmærksomhed. For at fremme vores understanding medfødte immunresponser i urinvejene under infektion med uropatogen Escherichia coli (UPEC), har vi udviklet et in vitro assay transuroepithelial neutrofil migration assay, der muliggør undersøgelse af polymorfkernede leukocyt (PMN; neutrofiler) bevægelse på tværs af en blære epitelbarrieren 6 -8. Som med andre to-kammer modeller af transepithelial migration, er dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden af en permeabel støtte og danner konfluerende epiteliale lag. Humane neutrofiler, isoleret fra venøst blod, der anvendes til den basolaterale side af epithellaget og migration over epitelet i fysiologisk relevant basolaterale-til-apikale retning kvantificeres som reaktion på infektion med forskellige stammer af E. coli eller tilstedeværelsen af kemotiltrækkende molekyler. Meget forskning havde fokuseret på neutrofil bevægelse, både kemokinese og kemotaksi i fravær af yderligere celletyper. Den transuroepithelial neutrofilmigration analysen er fordelagtig, da det tager hensyn til komplekse vekselvirkninger mellem blære epitelceller og immunceller under infektion. Dette medgørlig in vitro-model har potentiale til at tillade detaljeret undersøgelse af immunreaktioner på uroepitele overflader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af en dyrket blære epitelcellelinie og frisk isolerede humane PMN etablerede vi en in vitro model af transuroepithelial neutrofil migration. Denne model har været medvirkende begynder at dissekere kompleksiteten i respons det medfødte immunforsvar i løbet af urinvejsinfektion (UTI), en yderst almindelig bakteriel infektion typisk forårsaget af UPEC 9.. Under infektion af blæren eller blærebetændelse, er afgørende for bakteriel clearance 10 rekruttering af PMN til blære…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) giver R01-DK080752 og P50-DK064540. Vi takker J. Loughman for hendes indsats med at etablere denne analyse.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
